白灵菇多糖的提取及其免疫活性研究

李志涛，孙金旭，王倩，周红菊，楚志峰

（衡水学院生命科学学院，河北衡水053000）

白灵菇多糖的提取及其免疫活性研究

李志涛，孙金旭，王倩，周红菊，楚志峰

（衡水学院生命科学学院，河北衡水053000）

通过L18（37）正交试验，研究了物料粒度、料液比、微波功率、微波时间、提取温度、微波提取次数、乙醇与浓缩液比值这7个因素对白灵菇多糖得率的影响。试验结果表明：物料粒度、料液比、微波功率、微波时间、微波提取次数对白灵菇多糖得率均有显著地影响。并确定提取白灵菇多糖的最佳参数为：物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波时间6min、提取温度90℃、微波提取次数3次、乙醇与浓缩液比值4∶1（体积比）。在最佳条件下，白灵菇多糖提取率可达9.31%。通过小鼠脾淋巴细胞增殖的实验表明，在适当的剂量下，提取到的白灵菇多糖能明显提高小鼠的免疫功能。

白灵菇；多糖；提取；免疫活性

白灵菇是一种珍贵的食药两用的大型真菌，其营养价值和医疗保健功能很高。白灵菇多糖为其主要的生物活性成分[1]。目前国内常用热水法、碱溶液浸提法等方法提取白灵菇多糖[2-3]。但这些提取方法制备工艺繁琐，提取率也较低，目前，较新型的微波提取法具有操作简单、提取率高等优点[4]。而采用微波法提取白灵菇多糖的报道很少，为此，我们采用微波法提取白灵菇多糖，以白灵菇多糖为产物进行试验，以期确定提取白灵菇多糖的最佳参数，提高白灵菇多糖提取率，并对提取的多糖进行免疫活性研究，为进一步开发白灵菇提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

白灵菇：衡水学院食品学实验室提供。

1月龄清洁级小鼠：购自天津医科大学，体重为（20±2）g。

无水乙醇、无水乙醚、丙酮、苯酚：天津市金卫尔化工有限公司；葡萄糖：泰州市兴华化学品有限公司；浓硫酸：石家庄鑫隆威化工有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

FA1004C型电子天平：上海市平轩科学仪器公司；722型分光光度计：上海市美析仪器公司；VIP271型微波炉：顺德市惠尔浦蚬华微波制品公司。

1.2 方法

1.2.1 微波法提取白灵菇多糖[5]

1.2.1.1 提取工艺

白灵菇→粉碎（粉碎后分别过不同孔径筛网，调节物料粒度）→加蒸馏水（调节料液比）浸泡20min→微波辐射（分别调节微波功率、辐照时间、提取温度）→离心得上清液→浓缩至原体积的1/4→加入乙醇沉淀（调节乙醇用量与浓缩液比值）→4℃静置24 h→离心得沉淀→无水乙醇、丙酮分别洗涤→低温干燥→白灵菇多糖

1.2.1.2 正交试验

选用物料粒度、料液比、微波功率、微波时间、提取温度、微波提取次数、乙醇与浓缩液比值为试验因素，前期单因素试验研究了这7个因素对白灵菇多糖提取的影响。本试验根据前期单因素试验结果，用L18（37）正交表来设计正交试验。L18（37）正交表的因素水平见表1。

表1 L18（37）正交试验因素水平表Table1 L18（37）orthogonalexperim entaldesign factorsand level

1.2.1.3 白灵菇多糖的测定[6]

采用苯酚-硫酸法测定多糖。以葡萄糖的毫克数为横坐标，吸光度值（波长490 nm）为纵坐标，测得标准曲线（图1），回归方程为：y=6.735 2x，相关系数R2= 0.999 2。然后测定白灵菇多糖样品吸光度，根据标准曲线回归方程，计算样品中的多糖含量。

图1 苯酚-硫酸标准曲线Fig.1 Standard curveof phenol-vitriol

1.2.2 白灵菇多糖免疫调节活性的测定[7]

拉颈处死小鼠，无菌操作下取脾制备成细胞悬液。在96孔酶标板的每个孔中，加入100μL细胞悬液，再加20μL完全培养液为阴性对照；加10μLCon A（刀豆蛋白A），10μL完全培养液为阳性对照；实验组取白灵菇多糖样品，分别配制成1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL的溶液，加入10μL样品溶液和10μLConA于每个试验孔上，然后置于CO2培养箱（5%CO2、37℃）中，孵育72 h。在培养结束前6小时时，每孔加10μL新配制的无菌MTT（噻唑蓝，5mg/mL）。培养结束以后，每孔加入100μL 10%的SDS（十二烷基硫酸钠）来终止反应，测OD490nm值（光密度）。用刺激指数（Stimulate index，SI）来表示免疫调节活性，SI值越大，说明提取的白灵菇多糖的免疫调节活性越强。刺激指数的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 以白灵菇多糖为目的产物的试验分析

正交试验对白灵菇多糖得率影响的数据分析见表2、表3。

表2 L18（37）正交试验对白灵菇多糖得率影响分析Table2 L18（37）Orthogonal testanalysisof the impactof polysaccharide yield

表3 L18（37）正交试验对白灵菇多糖得率影响的显著性分析Table3 L18（37）orthogonal testof the impactof significant polysaccharide yield analysis

由表2、表3得知，物料粒度、料液比、微波功率、微波时间、微波提取次数对白灵菇多糖得率均有显著地影响，其它因素影响不显著。按各因素对白灵菇多糖得率的影响的重要性而论：C＞A＞D＞B＞F＞E＞G，即微波功率＞物料粒度＞微波时间＞料液比＞微波提取次数＞提取温度＞乙醇与浓缩液比值。由以上结果可知微波功率对白灵菇多糖得率的影响最大，并确定最佳试验组合为A2B1C2D2E3F3G2，即物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波时间6min、提取温度90℃、微波提取次数3次、乙醇与浓缩液比值4∶1（体积比）。

2.2 验证试验

由2.1确定正交试验最优组合为A2B1C2D2E3F3G2，采用此最佳组合进行验证试验，做3个平行样，取平均值后计算多糖得率为9.31%，此结果与正交试验最高值相比，多糖得率提高6.04%，说明优化结果较有意义。

2.3 免疫调节活性的测定

不同浓度的白灵菇多糖对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性影响见图2。

图2 不同浓度的多糖对小鼠免疫调节活性的影响Fig.2 Effectsof differentdosagesof sam pleson splenic lym phocyte multiplication

如图2所示，不同浓度的多糖的刺激指数均大于1（SI＞1），表明提取的白灵菇多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性具有促进作用，因此其对小鼠具有较好的免疫增强的作用。随着样品浓度的提高，其对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性的促进作用逐渐增强，但当样品浓度在超过5mg/mL时，随着样品浓度的增加，小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性增加的速度就非常缓慢，其机理有待于进一步研究。

3 结论

本文采用微波辅助提取法，通过正交试验确定提取白灵菇多糖的最佳试验参数为：物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波时间6min、提取温度90℃、微波提取次数3次、乙醇与浓缩液比值4∶1。然后按照最优组合进行了验证试验，得白灵菇多糖提取率为9.31%，结果证明该组合与未优化组合相比较，白灵菇多糖得率较高，而且其提取率远高于热水法（提取率为6.39%）或碱溶液浸提法提取的白灵菇多糖提取率（提取率为1.43%）[2-3]。并且通过免疫调节活性实验得知，在适宜浓度下，白灵菇多糖能明显的提高小鼠免疫功能，这为进一步开发具有免疫调节活性的功能食品提供了理论基础。

[1]马淑凤,陈利梅,徐化能,等.白灵菇多糖的分离纯化及清除自由基研究[J].食品科学,2009,30(19)：109-113

[2]马淑凤,刘长江.热水法提取白灵菇菌丝体多糖(PNMP)工艺的优化[J].食用菌,2009,31(1)：65-67

[3]刘海英,范永山,张运峰,等.白灵菇菌丝多糖碱溶液浸提法提取工艺的改进[J].北京农学院学报,2009,24(3)：55-58

[4]Bhattacharya M,Basak T,Senagala R.A comprehensive theoretical analysis for the effectofmicrowave heatingon the progressof a first orderendothermic reaction[J].Chemical Engineering Science,2011, 66(23)：5832-5851

[5]郭永月,陶明煊,赵云霞,等.白玉菇多糖提取方法的比较和优化[J].南京师大学报(自然科学版),2013,36(3)：87-92

[6]孙金旭,朱会霞,韩莉萍.灵芝真菌液体发酵培养基优化[J].中国酿造,2008,23(14)：52-54

[7]李志涛,梁魁景,马俪珍,等.鲶鱼体表黏液IgM的免疫活性研究[J].湖北农业科学,2013,52(1)：152-154,167

A Study on the Extraction and Immune Effect of Polysaccharide from Pleurotus nebrodensis

LIZhi-tao，SUN Jin-xu，WANGQian，ZHOUHong-ju，CHU Zhi-feng
（Departmentof Life Sciences，HengshuiUniversity，Hengshui053000，Hebei，China）

Theeffectofmaterialsize，the ratioofmaterial to liquid，microwave power，microwave time，extraction temperature，times andmultiple of ethanol on the yield of polysaccharide from Pleurotus nebrodensis was studied through L18（37）orthogonal experiment.Orthogonalexperimentanalysis showed thatmaterial size，the ratio ofmaterial to liquid，microwave power，microwave time and timesappreciable impact.The optimum conditionswere：material sizewas 0.150mm，the ratio ofmaterial to liquid was 1∶20（g/mL），microwave power was300W，microwave timewas6min，extraction temperaturewas90℃，timeswas3 andmultiple ofethanol was4∶1（ratiosof the volume）.Under the optimal circumstances，the extraction rate ofpolysaccharide could be up to 9.31%.The experiment of lymphocyte proliferation ofmouse's spleen showed that polysaccharide from Pleurotusnebrodensis atmoderate dose significantly promoted the immunologic function inmice.

Pleurotusnebrodensis；polysaccharides；extraction；immunoregulatoryactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.012

2016-06-15

李志涛（1983—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品科学。