PKM剪接体在伊马替尼敏感及耐药慢粒细胞中的差异表达

张静，李书琪，姜钰环，黄波，刘静，徐颜美，林晋，王小中

(南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

·论著·

PKM剪接体在伊马替尼敏感及耐药慢粒细胞中的差异表达

张静，李书琪，姜钰环，黄波，刘静，徐颜美，林晋，王小中

(南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

目的探讨丙酮酸激酶剪接体M1型（PKM1）和M2型（PKM2）在不同慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）细胞中的表达情况及意义。方法收集南昌大学第二附属医院确诊的伊马替尼(Imatinib，IM)敏感（n=23）和IM耐药（n=7）CML患者外周血或骨髓，采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的方法检测IM敏感CML细胞系K562、IM耐药CML细胞系K562/G01及30例临床样本中PKM1和PKM2表达水平。结果与K562细胞相比，K562/G01细胞中PKM2/PKM1的比值明显升高；IM耐药CML患者PKM2/PKM1的比值较IM敏感者显著上调。结论PKM发生异常剪接可能与CML细胞IM耐药相关。

丙酮酸激酶；剪接体；慢性粒细胞白血病；伊马替尼

伊马替尼(Imatinib，IM)耐药是CML治疗失败的主要原因之一，其耐药机制十分复杂，主要包括bcr-abl融合基因的表达上调，药理学改变等[1，2]。近年来，肿瘤细胞能量代谢异常导致化疗抵抗的现象引起了研究热点[3-5]。与正常细胞不同，肿瘤细胞即使是在氧气供应充足的条件下也采用糖酵解的方式来分解葡糖糖并获得能量的现象被称之为有氧糖酵解。由于肿瘤细胞发生代谢重塑这一特殊表型是由德国生理学家Warburg教授首次发现，因此也被称作Warburg效应。近期，研究者应用代谢组学技术对IM敏感与耐药的CML细胞株进行代谢分析，发现升高的糖酵解活性与IM耐药有关[6]，提示糖酵解可能在CML细胞IM耐药形成中发挥了重要的作用。付伟等[7]应用GEO数据库下载K562细胞和IM处理的K562细胞基因表达芯片数据，筛选得到重要差异表达核心基因包括PKM，表明PKM可能与CML细胞对IM抵抗密切相关。

1 材料与方法

1.1 研究标本的来源人CML细胞系K562细胞和IM耐药细胞株K562/G01均为本实验室保存。由于急变期CML几乎对所有常规化疗药物均有抗性，因此我们选择急变CML患者标本作为耐药CML研究对象。根据《慢性髓性白血病治疗专家共识（2010版）》[8]作为IM耐药诊断标准，IM治疗3个月未能达到完全血液学缓解，治疗6个月未能达到细胞遗传学缓解或治疗12个月未能达到主要细胞遗传学缓解，失去已经获得的完全血液学缓解或细胞遗传学缓解，疾病进展或出现耐药的Bcr－Abl激酶突变。选取2016年6月至2016年12月期间于南昌大学第二附属医院确诊的IM敏感的CML样本23例和IM耐药的CML标本7例。所有标本的使用符合南昌大学第二附属医院伦理委员会的伦理要求。

1．1．1主要试剂PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒（日本Takara公司），2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物技术有限公司）。

1．1．2仪器PCR基因扩增仪（美国BIO－RAD公司）

1．2方法

1．2．1 RT－PCR检测PKM1和PKM2表达水平收集南昌大学第二附属医院确诊的23例IM敏感和7例耐药患者的外周血或者骨髓，提取RNA，逆转录生成cDNA，根据PKM1、PKM2、GAPDH基因设计特异引物，采用2×Taq PCR Master Mix试剂盒检测PKM1、PKM2的相对表达。引物序列见表1。

表1 PCR反应引物的序列

表2 IM敏感和IM耐药CML细胞中PKM1、PKM2 mRNA灰度值

反应条件为：95℃5min；（95℃35s；退火温度见表30s；72℃30s）35个循环；72℃5min；以GAPDH作为内参。反应结束后，取PCR产物10μl进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR产物的大小是否与预测值相符合。

1．3统计学方法应用SPSS 22．0统计软件进行数据统计与分析，正态计量数据以均数±标准差（x±s）形式表示，两组间比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1比较不同CML细胞株中PKM2/PKM1比值变化为了检测IM敏感（NO．25）和耐药CML细胞株（NO．24）中PKM1和PKM2 mRNA表达情况，采用RT－PCR方法对K562和K562/G01细胞中PKM2/ PKM1比值进行检测。结果显示，与K562细胞相比，K562/G01细胞中PKM2/PKM1比值呈上升趋势（图1）。

2．2比较IM敏感和耐药的CML样本中PKM2/ PKM1比值差异为了进一步验证这一表达差异，我们收集了23例（NO．1－23）IM敏感CML样本和7例（NO．26－32）IM耐药的CML标本为研究对象，对其PKM1和PKM2 mRNA表达水平进行了灰度半定量检测与分析，见表2。结果同样发现，PKM2在IM耐药CML患者中高表达，PKM2/PKM1比值较IM敏感CML患者显著上调。

图1 比较不同CML细胞中PKM2/PKM1比值变化

3 讨论

IM已成为CML治疗的一线治疗选择，然而伴随出现的IM耐药已成为CML治疗的最主要障碍，其耐药形成的具体机制仍不清楚。研究发现，IM抵抗与CML细胞的代谢途径密切相关[7，9]。因此，能量代谢可能在CML耐药机制中起着重要作用。肿瘤细胞在缺氧情况下进行糖酵解产能可使其适应缺氧环境，保持生长优势。此外，肿瘤细胞糖酵解产生大量乳酸，可使肿瘤微环境改变，从而促进肿瘤的侵袭和转移[10-12]。丙酮酸激酶（PK）是肿瘤进行有氧糖酵解的必要条件，其不同的剪接产物PKM1和PKM2活性与肿瘤糖酵解紧密相关，但PKM剪接产物的表达水平与血液肿瘤化疗抵抗间的关系仍少见报道。

我们的研究结果显示：PKM2在IM耐药CML细胞中高表达，且PKM2/PKM1比值较IM敏感的CML细胞显著上调。提示PKM2表达升高，促进CML糖酵解，进而导致CML耐药现象。肿瘤细胞在缺氧条件下表现出葡萄糖利用增加，糖酵解增强的现象，通常认为该效应与缺氧诱导因子-1（HIF-1）相关，保证肿瘤细胞在无氧条件下的生存与增殖。研究报道，PKM2作为HIF-1的靶基因促进葡萄糖利用，降低氧耗；而PKM1缺乏缺氧反应元件，不能与HIF-1靶基因相互作用，难以满足缺氧条件下CML细胞快速增殖需求[13-15]。综上所述，PKM2促进了白血病细胞的代谢重编程，适应了白血病细胞过度增殖后能量代谢和合成代谢的需求，可能是IM耐药CML细胞中PKM2增加而PKM1减少的原因之一。因此，PKM2/PKM1比值有望成为预测CML细胞是否对IM耐药的潜在指标。

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Differencial expression of PKM spliceosomes in Imatinib sensitive and resistant CML cells

ZHANG Jing，LI Shuqi，JIANG Yuhuan，etal.Department of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanhcang 330006，China.

Objective To explore the expression levels and effects of the pyruvate kinase spliccesome PKM1 and PKM2 in different chronic myeloid leukemia(CML)cells.Methods CML patients diagnosed as imatinib(IM)sensitive(n=23)and IM resistant(n=7)were enrolled from the second affiliated hospital of Nanchang university，respectively.PKM1 and PKM2 mRNA levels were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in IM sensitive cell line(K562)，IM resistant cell line (K562/G01)and 30 clinical samples.Results PKM2/PKM1 ratio was significantly higher in K562/G01 compared with that in k562；the PKM2/PKM1 ratio in IM resistant patient was also obviously higher than that in IM sensitive patient.Conclusion Aberrant splicing of PKM is probably related to Imatinib resistance in CML cells.

Pyruvate kinase；Splicesome；Chronic myeloid leukemia；Imatinib

R733.7，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0140-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.002

2017-03-06；

2017-03-21)

国家自然科学基金项目(编号81271912)

张静，1990年生，女，南昌大学硕士研究生，主要从事血液病机制研究；李书琪，1993年生，女，南昌大学硕士研究生，主要从事血液病机制研究。张静和李书琪为共同第一作者。

王小中，1973年生，男，教授，博士研究生导师，主要从事血液病机制研究；E-mail：wangxzlj@126.com。