eEF1A2基因沉默的原发性肝细胞癌BEL-7402细胞株的建立

陈敦雁，黄毅，邱福南，伍严安，黄肖利，李峰，吴文冰

(福建医科大学省立临床医学院，1、检验科；2、肝胆外科；3、病理科，福建福州350001)

eEF1A2基因沉默的原发性肝细胞癌BEL-7402细胞株的建立

陈敦雁1，黄毅1，邱福南2，伍严安1，黄肖利1，李峰3，吴文冰1

(福建医科大学省立临床医学院，1、检验科；2、肝胆外科；3、病理科，福建福州350001)

目的本研究旨在构建针对高表达真核翻译延长因子1A2（eEF1A2）的原发性肝细胞癌（HCC）BEL－7402细胞株的eEF1A2－RNAi的细胞模型，为从基因沉默基因敲除层面研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用的功能奠定实验基础。方法通过针对eEF1A2基因的shRNA与线性化的GV115－GFP载体进行连接转化，对获得的重组子(GV115－GFP－eEF1A2－shRNA)进行PCR和测序鉴定。采用慢病毒载体系统将pHelper 1．0载体、pHelper 2．0载体与GV115－GFP－eEF1A2－shRNA共转染293T细胞，包装成eEF1A2－RNAi－LV，并感染高表达eEF1A2的BEL－7402细胞。采用Real time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证eEF1A2－RNAi－LV对BEL－7402细胞eEF1A2表达的抑制作用。结果成功构建了重组真核表达载体GV115－GFP－eEF1A2－shRNA，并通过慢病毒载体系统包装成eEF1A2－RNAi－LV；将eEF1A2－RNAi－LV转染至BEL－7402细胞后，细胞eEF1A2 mRNA和蛋白的表达水平分别下降了84．1%和64．5%，与阴性对照组相比较具显著性差异(P＜0．01)，表明转染后的BEL－7402细胞eEF1A2基因被特异性沉默。结论成功构建了eEF1A2－RNAi的BEL－7402细胞模型，为进一步从基因敲除层面研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用奠定了良好的实验基础。

真核翻译延长因子1A2；原发性肝细胞癌；BEL－7402细胞；RNA干扰；慢病毒载体

传统观念上人类真核翻译延长因子1A（eEF1A）被认为是管家蛋白，具有两种异构体：eEF1A1与eEF1A2，参与蛋白质翻译过程肽链的延长。但随着研究的深入，发现eEF1A具有促进细胞骨架重排、细胞增殖、核内转录活动的作用，并可参与磷脂酰肌醇、钙等信号转导途径的调节[1]。这种多功能蛋白的特性使eEF1A具有潜在致癌作用，尤其表达具有组织特异性的eEF1A2被发现在多种肿瘤中存在着异位高表达[2－5]，与肿瘤的发生发展及生物学行为密切相关。

原发性肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一。HCC恶性程度度高，进展快速，预后不良[6]。有学者利用微阵列-差异基因组杂交技术对HCC癌组织和细胞株进行基因表达谱和候选基因的功能分析，发现20q13.3上的eEF1A2基因存在过表达[7]。在我们前期的研究中，亦发现eEF1A2在HCC癌组织存在着异位高表达，且其过表达可对HCC细胞的生物学行为造成明显影响[8]。在此基础上，为了深入研究eEF1A2在HCC中潜在癌蛋白的作用，本文拟构建针对eEF1A2基因特定靶序列的shRNA慢病毒，并转染至前期研究已表明为eEF1A2高表达的HCC细胞株BEL-7402[8]中，建立eEF1A2-RNAi的细胞模型，为从基因沉默层面进一步研究eEF1A2基因在HCC发生发展过程中的作用建立基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人HCC细胞株BEL-7402购自中科院细胞所，用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的DMEM培养液（GIBCO公司），置37℃，5%CO2的培养箱中培养，2~3d换液传代一次。

1.2 eEF1A2-RNAi-LV的构建⑴eEF1A2-shRNA慢病毒载体的构建：根据GenBank数据库提供的eEF1A2基因(NM_001958)编码序列，按照siRNA设计原则，设计4条RNAi靶序列，RNAi#1：GTAC AAGATTGGCGGCATT，RNAi#2：AATGCGGAGGTA TTGACAA，RNAi#3：TCAAGAAGATCGGCTACAA，RNAi#4：ACTACATCACCATCATCGA；另设计阴性对照序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，经BLAST对比现有基因文库中所有人源基因均无同源性。合成含RNAi靶序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链，再克隆入含Age I/EcoR I双酶切位点的慢病毒表达载体GV115（购自上海吉凯基因化学技术有限公司）中，构建重组GV115-GFP-eEF1A2-shRNA-1，2，3，4的慢病毒表达载体和阴性对照慢病毒载体，转化感受态大肠杆菌DH5α后，挑取重组阳性菌落行PCR及测序鉴定。

⑵慢病毒包装与滴度检测：通过Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）将构建的重组慢病毒表达载体和相对应的包装质粒pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞，包装成eEF1A2-RNAi #1-LV、eEF1A2-RNAi#2-LV、eEF1A2-RNAi#3-LV、eEF1A2-RNAi#4-LV，48h后收集上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。即将病毒浓缩液10倍比梯度稀释，使每100μl培养液中分别含慢病毒原液2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7ml；各取100μl上述慢病毒稀释液加入每孔293T细胞中，于37℃培养箱中培养3d后，荧光显微镜观察各孔中荧光细胞数量并测定滴度，病毒滴度(TU/ml)=带有荧光的细胞数/病毒原液量。

1.3 BEL-7402细胞的慢病毒感染将获得的慢病毒按预先摸索的MOI值感染对数生长期的BEL-7402细胞，12h后吸去含病毒和聚凝胺的上清液，加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养，感染3d后在荧光显微镜下观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率大于80%者继续后续实验。实验设三组，分别为NC组：阴性对照组（感染阴性对照shRNA慢病毒的细胞组），CON组：空白对照组（未感染慢病毒的细胞组），KD1组：敲除1组（感染eEF1A2-RNAi#1-LV的细胞组），KD2组：敲除2组（感染eEF1A2-RNAi#2-LV的细胞组），KD3组：敲除3组（感染eEF1A2-RNAi#3-LV的细胞组），KD4组：敲除4组（感染eEF1A2-RNAi#4-LV的细胞组）。

1.4 Real-time PCR法检测BEL-7402细胞eEF1A2 mRNA的表达慢病毒感染5d后，收集各组细胞，用Trizol试剂（Invitrogen公司）提取总RNA，分别取2μg反转录成cDNA，以SYBR GreenⅠ（ABI公司）为荧光染料，在Real-time PCR仪（ABI 7300）上分别行eEF1A2和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因的扩增。eEF1A2上游引物：5'-GTCAAGGAAGTCAGCGCCTAC-3'；下游引物：5'-TGAACCACGGCATGTTGGG-3，扩增产物为124bp；GAPDH上游引物：5'-TGACTTCAACAGCG ACACCCA-3'；下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTA GCCAAA-3，扩增产物为121bp。Real-time PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-△△CT法比较各组eEF1A2 mRNA相对表达量。

1.5 Western blot法检测BEL-7402细胞eEF1A2蛋白的表达慢病毒感染5d后，收集各组细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白并测定含量；分别取等量总蛋白99℃变性5min，进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移至NC膜上；封闭NC膜1h，加入相应抗体4℃孵育过夜，其中GAPDH兔抗购自Cell Signaling Technology公司，eEF1A2兔抗购自Novusbio公司；TBS洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（KPL公司），室温孵育1h；TBS洗涤后加LumiGLO Chemiluminescent Substrat（KPL公司）室温下孵育1min，曝光，洗片，然后在Gel Doc凝胶图像分析仪（BIO－RAD公司）上扫描条带的灰度，并以GAPDH为内参，计算eEF1A2蛋白的相对表达量。

1．6统计学分析所有实验均重复三次，统计学处理均在SPSS 13．0统计软件包上进行。其中阳性率的比较采用χ2检验；定量数据采用均数±标准差（x±s）表示，两组间均值的比较采用t检验。

2 结果

2．1 GVll5－eEF1A2－shRNA慢病毒表达载体的测序结果GVll5与含特定RNAi靶序列的DNAoligo经酶切链接到病毒载体上，转染感受态细胞后用菌落PCR筛选阳性克隆，将PCR阳性克隆进行测序；在4种RNAi靶序列的慢病毒载体中，GVll5－GFP－eEF1A2－shRNA－4慢病毒表达载体的测序结果见图1，分析显示其含有正确的RNAi靶序列（下划线部分）：ccgggtACTACATCACCATCATCGA ctcgagTCGATGATGGTGATGTAGTactttttg。

图1 GVll5-GFP-e EF1A2-shRNA-4慢病毒表达载体的测序结果

2．2慢病毒滴度检测包装好的慢病毒经荧光法测定病毒滴度(TU/ml)=带有荧光的细胞数/病毒原液量=达4×108(TU/ml)。慢病毒感染293T细胞3d后，在倒置荧光显微镜下可见超过90%的细胞呈现明显GFP绿色荧光（见图2）。

图2 包装慢病毒感染293T细胞检测图

2．3 BEL－7402细胞的慢病毒感染效率在倒置荧光显微镜下观察感染慢病毒3d后的BEL－7402细胞，超过90%的细胞呈现明显GFP绿色荧光（见图3）。

图3 慢病毒感染BEL-7402细胞检测图

2．4 eEF1A2－RNAi－LV感染对BEL－7402细胞eEF1A2 mRNA表达的影响Real－time PCR法检测结果显示，与NC组相比较，KD1组、KD2组、KD3组、KD4组的eEF1A2 mRNA的表达水平分别下降了9．7%（P＞0．05）、40．9%（P＜0．05）、54．0%（P＜0．05）、84．1%（P＜0．01）；4种eEF1A2－RNAi－LV中，以eEF1A2－RNAi#4－LV对BEL－7402细胞eEF1A2 mRNA表达的抑制效率最高（见图4）。

图4 e EF1A2-RNAi-LV对BEL-7402细胞e EF1A2 mRNA表达的影响

2．5 eEF1A2－RNAi－LV感染对BEL－7402细胞eEF1A2蛋白表达的影响Western blot法检测结果显示，与NC组相比较，KD1组、KD2组、KD3组、KD4组的eEF1A2蛋白的表达水平分别下降了1．2%（P＞0．05）、19．6%（P＞0．05）、42．2%（P＜0．05）、64．5%（P＜0．01）；4种eEF1A2－RNAi－LV中，以eEF1A2－RNAi#4－LV对BEL－7402细胞eEF1A2蛋白表达的抑制效率最高（见图5）。

图5 e EF1A2-RNAi-LV对BEL-7402细胞e EF1A2蛋白表达的影响

2．6 eEF1A2－RNAi－LV感染BEL－7402细胞1个月后的稳定性验证倒置荧光显微镜下观察eEF1A2－RNAi#4－LV慢病毒感染1个月的BEL－7402细胞，结果显示超过90%的细胞呈现明显GFP绿色荧光（见图6）；Western blot法检测结果显示细胞eEF1A2蛋白表达的抑制率达61．3%（见图6）。

3 讨论

作为一种在人类免疫缺陷型病毒(HIV)基础上发展起来的基因治疗载体，慢病毒它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，转染效率高，并且可以将外源基因有效整合到宿主染色体上，达到稳定、持久性的表达，此外，慢病毒还具有不产生任何有效的细胞免疫应答，长期表达无病理损害现象发生的优点[9－11]，因此其日渐成为了一种理想的基因运输工具。RNAi是一种由双链RNA介导、由特定酶参与的特异性基因沉默技术，已被广泛应用于恶性肿瘤相关致癌基因功能与机制的研究中[12]。采用慢病毒作为shRNA的携带者，可充分发挥慢病毒载体自身所具备优势，使shRNA在被转染细胞实现稳定、持久性的表达，有利于特定基因表达沉默细胞模型的建立，为从基因敲除层面进行功能与机制的研究奠定了良好的实验基础。

图6 e EF1A2-RNAi-LV感染BEL-7402细胞1个月后的稳定性验证

为了保证shRNA序列的有效性，我们采用siRNA序列设计软件设计了4种针对eEF1A2的RNAi靶序列，测序结果显示序列成功整合入GV115载体中；将包装好的慢病毒导入BEL－7402细胞，显示感染效率高达90%以上；根据沉默作用的结果，我们最终选取编号RNAi#4的靶序列作为针对eEF1A2的RNAi有效靶序列：ACTACATCACCATCATCGA。Real－time PCR法与Western blot法检测结果显示，经含RNAi#4靶序列的慢病毒感染5d后，BEL－7402细胞eEF1A2 mRNA与蛋白的表达被明显抑制，与阴性对照组相比较，分别减少了84．1%与64．5%，提示该病毒能有效沉默BEL－7402细胞eEF1A2的表达。此外，对感染1个月后BEL－7402细胞的GFP绿色荧光与eEF1A2蛋白的表达情况予以检测，结果显示GFP的表达率仍高达90%以上，eEF1A2蛋白的表达仍被明显抑制（P＜0．01），说明本研究成功构建了eEF1A2基因稳定沉默的BEL－7402细胞模型。

作为一种传统的管家蛋白，eEF1A2仅存在于脑、心脏和骨骼肌，其表达具有组织局限性；但在对乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤癌组织的研究中，eEF1A2被发现存在异位高表达[2－5]，且能有效调节PI3K/Akt信号通路主要效应分子Akt的磷酸化，发挥潜在的致癌作用[13－14]。近来eEF1A2与HCC的相关性引起关注[7，15]。我们的前期研究结果表明eEF1A2在62例HCC癌组织的阳性率高达75．8%（47/62），而配对的癌旁组织仅5例呈弱阳性表达，正常肝脏组织均为阴性；过表达eEF1A2可增强HCC细胞的增殖能力，降低HCC细胞的分化程度，并促使细胞周期通过G0/G1期、进入S期和G2/M期，以上结果提示eEF1A2的过表达可能参与了HCC的发生发展进程[8]。细胞的增殖、分化及周期调控的生物学行为异常是肿瘤形成的重要基础，是否eEF1A2基因沉默亦能对HCC细胞这些生物学行为发挥影响有待探讨。为此，本研究运用慢病毒基因干扰技术构建了eEF1A2基因沉默的HCC细胞模型，验证结果表明该细胞模型实现了对eEF1A2基因的高效、稳定沉默，这为进一步从基因敲除层面深入研究eEF1A2在HCC潜在的致癌作用以及相应作用机制提供了理想的工具细胞，奠定了良好的实验基础。

[1]Ejiri S．Moonlighting function of polypeptide elongation factor 1： From actin bundling to zinc finger protein R1－associated nuclear localization[J]．Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(1)：1－21．

[2]Tomlinson VA，Newbery HJ，Wray NR，et al．Translation elongation factor eEF1A2 is a potential oncoprotein that is overexpressed in two－thirds of breast tumours[J]．BMC Cancer，2005，5(1)：1－7．

[3]Sun Y，Wong N，Guan Y，et al．The eukaryotic translation elongation factor eEF1A2 induces neoplastic properties and mediates tumorigenic effects of ZNF217 in precursor cells of human ovarian carcinomas[J]．Int J Cancer，2008，123(8)：1761－1769．

[4]Cao H，Zhu Q，Huang J，et al．Regulation and functional role of eEF1A2 in pancreatic carcinoma[J]．Biochem Biophys Res Commun，2009，380(1)：11－16．

[5]Sun Y，Du C，Wang B，et al．Up－regulation of eEF1A2 promotes proliferation and inhibits apoptosis in prostate cancer[J]．Biochem Biophys Res Commun，2014，450(1)：1－6．

[6]王群书．联合监测血清AFP、AFU在原发性肝癌早期诊断中的应用[J]．实验与检验医学，2011，29(6)：665－666．

[7]Schlaeger C，Longerich T，Schiller C，et al．Etiology－dependent molecular mechanisms in human hepatocarcinogenesis[J]．Hepatology，2008，47(2)：511－520．

[8]黄毅，邱福南，陈敦雁，伍严安，李峰，黄肖利，吴文冰．eEF1A2在原发性肝细胞癌的表达[J]．中国病理生理杂志，2015，31(12)：2144－2150．

[9]Ellis J．Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors[J]．Hum Gene Ther，2005，16(11)：1241－1246．

[10]Dissen GA，Lomniczi A，Neff TL，et al．In vivo manipulation of gene expression in non－human primates using lentiviral vectors as delivery vehicles[J]．Methods，2009，49(1)：70－77．

[11]Manjunath N，Wu H，Subramanya S，et al．Lentiviral delivery of short hairpin RNAs[J]．Adv Drug Deliv Rev，2009，61(9)：732－745．

[12]琎，方国恩，王嘉锋．RNA干扰在胃癌治疗中的研究进展[J]．世界华人消化杂志，2007，15(11)：1252－1256．

[13]Xu C，Hu DM，Zhu Q．eEF1A2 promotes cell migration，invasion and metastasis in pancreatic cancer by upregulating MMP－9 expression through Akt activation[J]．Clin Exp Metastasis，2013，30 (7)：933－944．

[14]Amiri A，Noei F，Jeganathan S，et al．eEF1A2 activates Akt and stimulates Akt－dependent actin remodeling，invasion and migration [J]．Oncogene，2007，26：3027－3040．

[15]Pellegrino R，Calvisi DF，Neumann O，et al．EEF1A2 inactivates p53 by way of PI3K/AKT/mTOR－dependent stabilization of MDM4 in hepatocellular carcinoma[J]．Hepatology，2014，59(5)：1886－1899．

Establishment of eEF1A2 Gene Silenced BEL-7402 Cell Line

CHEN Dunyan1，HUANG Yi1，QIU Funan2，WU Yanan1，HUANG Xiaoli1，LI Feng3，WU Wenbing1.1.Department of Clinical Laboratory；2.Department of Hepatobiliary Surgery；3.Department of Pathology，Provincial Clinical College，Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China.

Objective To construct model cell line of eukaryotic elongation factor 1A2(eEF1A2)－RNAi in BEL－7402 cells with highly eEF1A2 expression as to provide a experimental basis for investigating the putative oncogene role of eEF1A2 on hepatocellular carcinoma(HCC)by the way of gene knockdown．Methods The shRNA targeting to eEF1A2 was ligated into linear GV115－GFP vector and transformed．Positive clone was identified by PCR and Sanger sequencing．pHelper 1．0，pHelper 2．0 and GV115－GFP－eEF1A2－shRNA were cotransformed into 293T cells by lentivius(LV)vector system，and then eEF1A2－RNAi－LV was transfected into BEL－7402 cells．The efficiency of eEF1A2－RNAi－LV on mRNA and protein in the infected cells were detected by real time PCR and western blot respectively．Results The recombinant eukaryotic expression vector GV115－GFP－eEF1A2－shRNA was constructed seccessfully and packed into eEF1A2－RNAi－LV by LV system．eEF1A2－RNAi－LV was transfected into BEL－7402 cells．Compared with negative control cells transfected with negative control LV，eEF1A2 mRNA and protein expression levels of BEL－7402 cells transfected with eEF1A2－RNAi－LV were significantly reduced 84．1%and 64．5%respectively (P＜0．01)．Conclusions It is concluded that the model cell line of eEF1A2－RNAi in BEL－7402 cells is successfully constructed，which might contribute to exploring the putative oncogene role of eEF1A2 on HCC by the way of gene knockdown．

Eukaryotic elongation factor 1A2；Hepatocellular carcinoma；BEL－7402 cell；RNA interference；Lentivirus vector

R735．7，R446．62

A

1674－1129(2017)02－0148－05

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．004

2016－09－18；

2017－03－15)

福建省卫生系统中青年骨干人才培养项目（No.2013-Z QN-JC-2）；福建省科技计划重点项目（No.2014Y0009）

陈敦雁，男，1983年生，硕士学位，主管检验师，医学分子和免疫学方向。

黄毅，男，1971年生，博士学位，主任检验师，医学分子和免疫学方向，E-mail：hyi8070@126.com。