六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究

李志龙

摘 要：目的：就六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱开展研究分析。方法：选用Dikma Diamonsil C18色谱柱，流动相梯度洗脱为乙腈-水，其中乙腈内所含磷酸的比例为0.05%，水中所含磷酸的比例为0.05%。研究中将柱温控制在40℃并掌握好流速。在不同的时间段内检测波长也存在一定差异，以20μL为进样量。本次实验研究中选取规范的色谱峰指认方法，即Q-TOF-MS-IDA-MS/MS。结果：实验结果显示，此种方法能够对共有峰中的18个色谱峰进行定性鉴别，具有良好的精密度和稳定性。以此种方式对六味地黄浓缩丸进行测定，可见相似度在0.96以上。结论：本次HPLC指纹图谱研究为六味地黄浓缩丸的质量评价提供可靠的依据。

关键词：六味地黄浓缩丸；HPLC；指纹图谱；质量评价

六味地黄是中药中的经典名方，以滋阴补肾受到广泛关注，该方主要由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻等成分依照标准质量比所組成。随着医学的不断进步，现代药理研究也更为深入，发现六味地黄方对内分泌以及免疫系统具有良好的调节作用，其优良的药理作用主要体现在抗氧化、抗衰老以及改善肾功能等多个方面，以此方位基础不断改进后所形成的六味地黄加减方，在临床医学上发挥着重要的作用。为加强六味地黄丸质量控制，本文旨在通过对六味地黄浓缩丸进行HPLC指纹图谱研究，以提高色谱峰指认的合理性，为六味地黄浓缩丸的质量控制提供可靠依据。

1 材料

本次研究中所选用的仪器设备主要有高效液相色谱仪、超声清洗器、电子天平以及数据传力软件。研究中所选用的六味地黄浓缩丸是来自河南某制药公司的不同批次药品。丹皮酚购自食品药品检定研究院，水为纯净水，乙腈和甲醇为色谱纯，磷酸与甲酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 制备单味药材供试品溶液

自S1-S10号中分别称取0.5g六味地黄浓缩丸样品，置于标准规格的锥形瓶内，在50℃条件下，进行时长15min的超声提取三次，第1次加甲醇进行提取，后两次分别加入甲醇提取，在2500r·min-1离心条件下，25min后对提取液进行合并定容。

精密吸取上述溶液1.0mL并加以浓缩除醇厚，以1.0mL纯水进行复溶，之后对该溶液进行精密吸取100μL，加入至完全活化的3.0mLSPE柱中，分别以1.0mL水和甲醇进行洗脱处理，可以得到甲醇洗脱液，待0.45μm微孔滤膜过滤后方可进行HPLC分析。除此之外，茯苓、山药、泽泻、熟地黄等在粉碎后称取标准量药材粉末，依照上述方法进行操作，即可制得单味药材供试品溶液。

2.2 色谱条件

DikmaDiamonsilC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相乙腈（A，含0.05%磷酸）-水（B，含0.05%磷酸），梯度洗脱，0～5.5min，4%A；5.5～10min，4%～5%A；10～26min，5%～30%A；26～33min，30%～32%A；33～42min，32%～80%A；42～53min，80%～90%A。柱温40℃；流速1.0mL·min-1；检测波长276nm（0～10min），236nm（10～40min），276nm（40～60min）；进样量20μL。

2.3 质谱条件

本次实验研究中，以ESI源作为离子源，为保证正负离子数据采集的可靠性，采用一级全扫描的方式，并掌握好数据采集速度，最好在5Hz左右，将扫描范围控制在m/z100-1000。以最多对一级质谱图中10个母离子的MS/MS质谱图作为信息采集工作模式开展数据收集，源温度为600℃最佳，雾化气应当为414Pa，卷帘气为214Pa。除此之外，在操作中应当保持动态背景扣除处于开启状态。

2.4 指纹图谱的建立以及共有指纹峰的指认

为更好的建立指纹图谱，应当取供试品溶液20μL，依照标准色谱条件进行测定，可得出不同批次下六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱，依据不同色谱峰相对保留时间，可以确定共有峰，进一步依据特征指纹峰建立指纹图谱，如图1所示。

六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱中明显显示，共有指纹峰22个，其中16号峰为参照风，以此为依据能够对不同色谱峰的保留时间以及保留面积进行准确计算，便于其与同一图谱中参照峰的保留时间以及保留面积参数值进行对比分析。计算后的相对保留时间与相对峰面积见表1、2。

在对共有指纹峰进行准确指认的基础上，应当对共有指纹峰的来源进行合理确认。这就需要研究人员对六味地黄浓缩丸提取液HPLC图与山药、茯苓、熟地黄等单味药提取液HPLC图进行对比分析，在指纹峰保留时间的对比下可以明确不同单味药的特征峰。其中，1号、5号和15号共有峰为熟地黄的特征峰，2号、4号共有峰为酒制山茱萸和熟地黄的特征峰，3号为酒制山茱萸和牡丹皮的特征峰，除此之外，6-9号和10-14号、18-19号为酒制山茱萸特征峰。10，16，17，21号共有峰为牡丹皮的特征峰；20号共有峰为牡丹皮和泽泻的特征峰；22号共有峰为茯苓、山药、泽泻、牡丹皮的特征峰。

2.5 方法学考察

精密度试验中，取同一供试品溶液连续测定5次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD<0.7%，相对峰面积RSD<4.0%（7，17号峰RSD为5.0%～13%），表明仪器稳定，精密度良好。

稳定性试验中，取同一供试品溶液分别在0，2，6，12，24h测定其指纹图谱，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD<0.50%，相对峰面积RSD<5.0%（6，7，8，15号峰RSD为7.0%～13%），表明供试品溶液在24h内基本稳定。

重复性试验中，平行处理同一批次样品5份，分别测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD<0.90%，相对峰面积RSD<4.0%（7，17号峰RSD为7.0%～28%），表明该方法重复性良好。

上述方法学考察试验中，个别色谱峰RSD，较大，分析其原因主要为六味地黄浓缩丸成分较复杂，且指纹图谱基线不平稳，同时上述色谱峰峰面积相对于其他色谱峰较小，造成工作站系统自动积分误差，采用手动积分可尽量减小误差。

3 讨论

研究表明，中药的质量控制是一项复杂的工作，由于其组成属性为多组分，因此在质量控制的过程中应当全面的反映出其物质组成属性，也就是说，应当中药的提取、纯化处理以及分析条件的选择，都是比较重要的环节，应当确保中药中所含多组分得以准确表征出来，从而加强中药质量控制。中药指纹图谱是现代科学技术不断进步的基础上所形成的一种分析方法，能够全面、定量的将中药中所包含的化学信息技术反映出来，但在实际应用中仍有待进一步完善。通过本次研究可知，采用双波长切换法能够更加准确的将不同波长下的色谱信息进行记录，提高色谱峰的丰富性，从而清晰且准确的反映出六味地黄浓缩丸的质量。

参考文献

[1] 高新彪，孙磊，乔善义，高松，车彦忠.六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究[J].中国中药杂志，2012，37（22）：3411-3415.

[2]高新彪.六味地黄浓缩丸化学成分指纹图谱研究[D].沈阳药科大学，2012.