铁线莲属植物遗传标记研究进展

和文志+杨玲+王昌命

摘要：指出了铁线莲属植物具有很高的观赏和药用价值，在园林绿化中有广泛地应用。从形态学标记、细胞学标记及DNA分子标记3个方面总结了铁线莲属植物研究现状，并且展望了遗传标记在铁线莲属植物的应用前景。并提出了遗传标记技术可以应用于铁线莲属植物遗传变异分析、品种分类及遗传多样性评价等的研究。

关键词：铁线莲；遗传标记；研究进展

中图分类号：S53

文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2017）6-0191-04

1 引言

铁线莲属（Clematis L.）植物隶属于毛茛科，有“藤本花卉皇后”的美称，广泛分布于世界各地，全世界约有300余种。中国约有该属植物133种，分布较广，主要分布在西南地区[1，2]。该属植物花期长，花型大且色泽丰富，包含白、粉红、深蓝、紫色等颜色，具有很高的园艺观赏价值[3]。在欧洲、日本、新西兰、美国等国家占有十分重要地位，大部分植物园、公园和家庭花园都能见到。此外，铁线莲植物因其含有各种药物活性成分，自中华文明发源以来就一直做为传统药材使用，以根及全株入药。近年来从各种不同铁线莲植物中发现了三萜皂甙、黄酮、香豆素、生物碱及其他许多活性成分[4～6]，这些活性成分具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化、保肝利胆及抗风湿等作用[7]，铁线莲属植物的药用价值更是激起了人们对铁线莲属药用资源植物的研究热情。

遗传标记（genetic marker）是指可追踪染色体，染色体某一些节段，某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。生物体任何可遗传的基因突变导致的表型差异都可以作为遗传标记。遗传标记的发展经历了形态学标记（morphological marker）、细胞学标记（cytological marker）、生物化学标记（biochemical marker）及分子标记（molecular marker）4个阶段。但是生化标记铁线莲属植物研究中未见报道，其余几种遗传标记技术的应用相对比较广泛。遗传标记的应用可以为铁线莲属植物的亲缘关系分析、遗传变异及品种分类等研究提供依据。

2 铁线莲属植物的形态学标记

在铁线莲属植物遗传多样性的研究中，形态学标记是最传统、最简便的方法。通过对铁线莲属植物的表现性状如根、茎、叶、花、果实和种子形态特征及生理性状的观测，可以用于种间分类和亲缘关系鉴别等方面的研究。最早由林奈于1753年建立了铁线莲属，并且根据茎形态特征不同将9种铁线莲划分为攀援类和直立类，还建立了长瓣铁线莲属（Atragene L.）。此后，1818年De Candolle根据总苞、萼片、雄蕊及花柱等形态特征对铁线莲属分类进行了修订。1885年Kuntze根据花柱、雄蕊、萼片等花部形态特征对铁线莲属属下类群进行分类整理，但其并不承认由De Candolle建立的Naravelia属。1987年日本学者Tamura根据幼苗叶片、花萼、雄蕊等形态的描述，将铁线莲属植物划分为4个亚属[8]。2000年Grey-Wilson C以花萼水平开展、雄蕊无毛作为原始类群，以花萼钟状（或管状）、雄蕊被毛作为进化类群，将铁线莲属划分为9个亚属，这与日本学者Tamura的观点相反[9]。2000～2006年，王文采[10～15]通过对铁线莲属植物的营养、生殖器官的特征進行描述，根据该属植物的形态学特征建立了毛茛科铁线莲属新的分类系统，但该分类系统不赞同前人将Naravelia属划分成组的处理。2007年孙诚等[16]通过对全世界约2000份铁线莲腊叶标本的形态学特征调查结果进行系统发育重建，并且对部分种群进行重新分类，但其研究结果不支持王文采将subsect.Connatae亚组下划分的一个系ser.Pogonandrae。

形态学标记不仅用于铁线莲属早期的形态分类、遗传进化和亲缘关系的研究，而且用于该属植物的适应性、观赏性和园艺性状改良等方面的研究。闫双喜等[17]阐述了河南境内的铁线莲的分布和观赏特性，对河南铁线莲属植物开发进行了探讨。刘立波等[18]描述了从欧洲引进的6个栽培品种株高、花期、花冠颜色、萼片个数和花径等性状，并对其适生性进行评价。蒋京桥等[19]对毛茛铁线莲花期、单花的形态与功能形态及结实率等生物学特性进行了报道，讨论了毛茛铁线莲结实率低的原因和解决方法。

3 细胞学标记

细胞学标记是一种把染色体的形态结构的变异作为遗传学标记的研究方法。一般是利用核型分析的方法对染色体的数目、形态进行分析。染色体形态结构与外部形态结构相比受外界环境因素的影响更小。通过对有丝分裂中期的染色体数目、形态结构的分析从而在细胞学水平上对铁线莲进行种属分类，探讨物种的遗传进化和亲缘关系。早在1985年龚维忠等[20]对来自北京和东北地区铁线莲属的11个种的核型进行了研究，结果表明仅有1种为异源四倍体（2n=4x=32），其余10种为二倍体（2n=2x=16），认为铁线莲核型的进化方式分为四种：二倍体到多倍体，最长与最短染色体比值增大，结构变异和由st演化到t型。张镒锂[21]对我国铁线莲属的7个种的染色体形态和数目进行了描述，证明了前人铁线莲属染色体演化趋势是由对称到不对称的研究推论。2011～2015年，盛璐[22，23]先后研究了16种国内野生铁线莲和7种购于国外的铁线莲的染色体数量和形态特征。结果表明，铁线莲属染色体数目稳定，基数x=8。除圆锥铁线莲的染色体为32条外，其余都为16条。核型属于比较原始的“2A”型。平均臂比值为1.80～3.31之间。连同前人已报道的共计32种铁线莲根据核型聚类分析发现核型分类与形态学分类结果并不完全一致，作者又从分子水平进行了深入研究。彭绿春等[24]分析了4个野生种和6个国外引进栽培品种铁线莲组培幼苗根尖细胞染色体形态特征。结果表明，除“杰克曼”染色体为14条外，其余染色体数均为16条。根据核型似近系数的聚类分析结果与形态学分类部分结果是一致的。

4 DNA分子标记

分子标记是继表型、生理、形态和生化标记后发展起来的以核苷酸链多态性为基础的遗传标记。分子标记反映了生物个体的可遗传的核酸序列变异特征，是DNA分子多态性的直接显现。与其它遗传标记相比，DNA分子遗传标记具有数量丰富，信息量大；取材不受生长发育的影响；拥有较多共显性，信息位点完整；基因组中的非编码区DNA序列不易受环境因素影响，而且具有操作简单、迅速等优点。目前在铁线莲属植物研究中运用到的分子标记技术主要一方面基于PCR技术的分子标记：随机扩增多态性DNA标记（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），简单重复间序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）分子标记以及聚合酶链式反应及单链构象多态性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）。另一方面基于DNA序列分析的分子标记：核糖体DNA内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析等。

4.1 RAPD分子标记

RAPD分子标记以植物基因组DNA为模板，利用人工合成的随机引物进行PCR扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺就凝胶电泳、染色剂染色之后就可以检测产物的多态性[25]。该标记方法广泛用于物种亲缘关系鉴定和遗传进化的研究。张荣等[26]用RAPD法分析了铁线莲属7种中药。结果表明RAPD法用于生药鉴定是可行的。后来普春霞等[27]对云南省具有药用价值的12种铁线莲进行了RAPD分析，利用10个随机引物对材料DNA扩增得到89条多态性带，发现条带多态性百分比100%，不同种扩增出的条带差异明显。遗传聚类分析结果表明RAPD分子标记技术可以用于铁线莲属生药鉴定，但是利用该标记技术进行系统重建还有待进一步研究。国锦琳等[28]不仅利用RAPD法筛选出5个多态性好的引物对10种川木通进行扩增，而且在此基础上构建了特征性序列扩增区域（sequence characterized amplified region，SCAR）标记，用于川木通药材鉴定。Yuan等人[29]对从中国各地采集到的Clematis tubulosa，Clematis brevicaudata不同种群及其杂交后代进行RAPD标记和SNP分析后发现，C. brevicaudata种群遗传背景一致，而C. tubulosa种群中检测到较多变异，由这两个亲本（不管是正交还是反交）产生的杂交后代通过RAPD可聚类成为2支，且大多数为源于C. tubulosa的突变植株。

4.2 ISSR-PCR分子标记

ISSR-PCR分子标记技术是以锚定的串联重复序列为引物进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺就凝胶电泳，经过银染或EB染色后对条带进行分析[30]。该方法广泛应用于种质资源和物种亲缘关系鉴定以及物种遗传多样性研究。孙正海等[31]运用单因子试验和正交试验对滑叶藤ISSR-PCR反应体系进行了优化，提出了滑叶藤ISSR-PCR的反应中模板DNA、TaqDNA聚合酶、Primer浓度、dNTPs浓度及Mg2+浓度的最佳条件。此外，王楠等[32]采用单因子实验设计对铁线莲园艺品种‘Gravetye Beauty的ISSR-PCR反应体系進行优化，并筛选出11条扩增条带清晰、多态性好的引物。Cires E等[33]利用ISSR和AFLP对伊比利亚半岛西北部濒危物种R.cabrerensis及其亚种进行研究，分别扩增出2830和103条条带，发现多态性比率分别为97.57%和81.38%。方差分析（AMOVA）结果表明该种的遗传变异主要来自于不同的地理群体内部，不同地理群体之间的差异达到显著水平。作者对R.cabrerensis的遗传结构进行一系列分析，还提出了对该种植物种质资源的保护策略。

4.3 PCR-SSCP标记

PCR-SSCP标记技术是基于单链DNA不同构象来检测基因突变的方法。该方法利用特异引物对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物经过变性剂和高温处理DNA双链解链形成具有某一空间构象的单链DNA。经过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色对电泳条带进行SSCP图谱分析。根据条带的不同位置显示不同个体之间的DNA的特性[34]。该技术广泛用于基因突变检测和物种鉴定。安蕊利用PCR-SSCP谱带分析技术对铁线莲属3种基原植物进行物种分类及鉴别。此外，还通过对比分析威灵仙药材基原ITS序列，设计出能够扩增出特异鉴别位点的引物，也正是利用了PCR-SSCP技术的经济、高通量的特点[35]。

4.4 ITS序列分析

ITS序列片段由于长度相对保守、信息位点丰富且属、种间差异明显的特点而多被用于药材品种鉴定。蒋明等[36]对浙江境内铁线莲属的8种药用植物进行ITS序列对比。结果显示了这8种铁线莲植物的ITS1和ITS2之间的长度为534～561bp，变异位点及信息位点较为丰富，同时对其遗传距离和亲缘关系进行了分析。李骁等[37]利用PCR法扩增了铁线莲属蒙药材的rDNA-ITS序列，经过序列的分析比对，从6种药用植物中ITS序列中，筛选出变异位点57个，特异性鉴别位点33个，证明了ITS序列可以用于鉴别铁线莲属药用植物。郑安勇[38]利用PCR技术扩增出18份威灵仙药材及混伪品的核基因ITS2序列，序列经过测序、拼接及数据分析比对，发现正品与混伪品的二级结构差异明显，以核基因ITS2片段为DNA条形码可以鉴定威灵仙药材中的混伪品。同样地，刘美子等[39]利用ITS2片段条形码也可以鉴别川木通与混伪品及近缘种。由于ITS序列短，提供的性状数量少，有学者将ITS序列分析与其它分析技术相结合探讨铁线莲属植物的遗传进化关系。如穆琳、谢磊利用槭叶铁线莲的ITS和3个叶绿体DNA片段，经目的片段扩增、基因测序之后构建系统发育树，结果不支持将槭叶铁线莲与绣球藤组聚为一类，认为槭叶铁线莲可能是北温带古老类群的孑遗[40]。

5 展望

目前，有关铁线莲属植物研究中形态学标记和细胞学标记的应用较为广泛，但是形态学标记是基于个体性状的描述，易受外部环境因子的影响，依据形态进行种群分类产生了很多争议。而且细胞学标记与传统的形态标记在铁线莲属植物遗传进化关系的研究结果也有许多差异。遗传标记在本属植物的研究中，生物化学标记应用未见报道。生物化学标记可以反映同一基因产物蛋白的差异性，不易受环境因素影响，而且还具有经济、快速的特点。所以可以加强生物化学标记技术在铁线莲属植物研究中的应用，填补生化标记在铁线莲属应用的空白。此外，虽然DNA分子标记在铁线莲属的研究中已经取得一定的成果，但是已应用到的DNA分子标记技术还较少。铁线莲属植物已有几百年的栽培历史。尤其是是在欧洲，育种专家多以杂交育种的方式培育出很多栽培品种，这些栽培品种的遗传背景十分复杂，品种分类有较多争议，因此在今后的研究中可以将多种遗传标记手段相结合，从多方面入手加大铁线莲的基础和应用研究，健全铁线莲种质资源的分类和评价体系，对铁线莲种质遗传多样性的保护、开发利用及优良品种的培育提供参考依据。

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