HPLC－DAD法同时测定蘸料和火锅底料中的3种合成色素

庞秀清，马莹，邱红燕，伍曦，赵丽，李泽夏琼

（贵州省食品药品检验所，贵阳 550004）

HPLC－DAD法同时测定蘸料和火锅底料中的3种合成色素

庞秀清，马莹，邱红燕，伍曦，赵丽，李泽夏琼

（贵州省食品药品检验所，贵阳 550004）

目的：建立蘸料和火锅底料中胭脂红、诱惑红和赤藓红含量测定的HPLC－DAD方法。方法：采用Agilent Eclipse XDB－C18色谱柱，以0.02mol／L乙酸铵溶液（含0.2%三乙胺，冰醋酸调pH至4.0）＋甲醇为流动相，梯度洗脱。制备模拟阳性样品并进行方法学考察，用石油醚对样品进行脱脂，以无水乙醇－2%氨水－水（7∶2∶1）为溶剂提取样品中的色素，用聚酰胺及固相萃取小柱除杂质、提纯，用3种色素的光谱确认疑似物质。结果：3种色素质量分别在50.02～400.12，53.24～425.96，51.90～415.22ng范围内与峰面积呈良好线性关系，蘸料及火锅底料中3种色素的加样回收率均高于97%，RSD均低于2.0%。方法的最低检出限为胭脂红0.1ng，诱惑红0.1ng，赤藓红0.2ng。结论：该方法精密度高，重现性好，定量准确，可对蘸料和火锅底料中添加的3种合成色素进行有效监控。

HPLC－DAD；蘸料；火锅底料；合成色素；固相萃取

蘸料种类繁多，通常与火锅、烧烤、素菜等食物一起被食用，是我国居民餐桌上重要的佐餐食品；火锅底料是制作火锅所用汤底和作料等的混合物，在全国范围内同样被广泛食用。辣椒是蘸料和火锅底料的重要组成部分及原料。为了使蘸料及火锅底料色彩更鲜艳，部分餐饮企业或食品加工企业可能向其中添加过多的合成色素。大量食用合成色素会对人体造成危害［1］。本文拟建立蘸料及火锅底料中3种合成色素的HPLC含量测定方法，以完善对蘸料及火锅底料的质量安全监控。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998二极管阵列（DAD）检测器，Empower色谱工作站；Agilent Eclipse XDB－C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；Phenomenex C18预柱（4mm×0.3mm）；JYL－C020匀浆机（九阳股份有限公司）；TALBOYS涡旋震荡器（Henry Troemner LLC）；TDL－5－A离心机（上海安亭科学仪器厂）；GM－0.33A隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；G3垂熔玻璃漏斗。

1.2 材料

色素对照品由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供，胭脂红批号91120，含量70.0%；诱惑红批号80917，含量83.0%；赤藓红批号90825，含量91.7%；蘸料和火锅底料样品为市场抽取样品（经HPLC检测不含上述3种色素）；聚酰胺粉（100～200目）由国药集团化学试剂有限公司提供，批号F20110104；Sep－Pak Plus QMA固相萃取小柱，规格360mg，颗粒度37～50μm；HPLC流动相所用甲醇为色谱纯，水为实验室自制去离子水，其余试剂、试药均为分析纯。

2 方法与结果［2－6］

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称取胭脂红、诱惑红、赤藓红对照品0.01429，0.01283，0.01132g，分别置于25mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为3种色素的标准储备液；分别精密吸取上述标准储备液各5mL，置同一20mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为混合标准储备液；精密吸取混合标准储备液1mL，置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合标准品溶液，其中胭脂红浓度为10.00μg／mL，诱惑红浓度为10.65μg／mL，赤藓红浓度为10.38μg／mL。

2.2 样品分类及预处理

需要检测色素的蘸料样品一般分为两类：固体类（辣椒面等）和固液混合类（辣椒蘸水）。固体类样品直接取样，固液混合类样品混匀后取样，在70℃水浴中挥干水分，进行前处理。火锅底料样品一般为油水混合物，先将样品冷藏过夜，然后将凝固的油脂取出称重，再将剩下的水层称重，取水层在80℃水浴中挥干水分，进行前处理，如检出色素，则将油脂重量代入，计算火锅底料中色素的含量。

2.3 模拟阳性样品及供试品溶液的制备

2.3.1 胭脂红及诱惑红供试品溶液的制备

取上述样品适量，混匀，取2g，精密称定，置于50mL具塞离心管中，加入石油醚（60～90℃）15mL，置涡旋机上，涡旋振荡5min，再置离心机中，离心（5000r／min）5min，弃去石油醚，按上述方法反复脱脂3次。脱脂后的样品置70℃水浴中挥干残留的石油醚，加入无水乙醇－2%氨水－水（7∶2∶1）15mL，置涡旋机上，涡旋振荡5min，再置离心机中，离心（5000r／min）5min，将提取液倒入50mL烧杯中。按上述方法反复提取色素6次，至提取液无色或近无色，合并提取液。将上述提取液置70℃水浴中挥至无氨味，继续挥至约10mL，依次加入10%硫酸溶液1mL和10%钨酸钠溶液1mL，搅匀，静置20min，将溶液及沉淀全部转移至50mL离心管中，并用60℃的水约15mL少量多次清洗蒸发皿，清洗液并入离心管中，离心（5000r／min）5min，上清液倒入50mL烧杯中，沉淀再加水约5mL，涡旋振荡5min，离心（5000r／min）5min，上清液合并入烧杯。

将上述烧杯置于80℃水浴中，提取液蒸至无氨味，继续蒸至约10mL，将聚酰胺粉1g倒入溶液中，搅匀，静置20min，趁热将溶液和聚酰胺粉全部转移至G3垂熔漏斗中，抽滤，用pH 6的水清洗聚酰胺粉5次，每次5mL，再用甲醇－甲酸（3∶2）清洗聚酰胺粉6次，每次5mL，至洗出液无色或近无色，再用水清洗聚酰胺粉至洗出液呈中性。用无水乙醇－2%氨水－水（7∶2∶1）洗脱色素6次，每次5mL，至洗出液无色或近无色，合并洗脱液，置蒸发皿中，置80℃水浴中挥至近干，转移至5mL量瓶中，用水清洗蒸发皿，合并入量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，离心（5000r／min）5min，取上清液作为胭脂红、诱惑红供试品溶液。

2.3.2 赤藓红供试品溶液的制备

取上述样品适量，按2.3.1中的方法处理至蛋白质沉淀步骤（……，上清液合并入烧杯。）将上述烧杯置于80℃水浴中，提取液蒸至无氨味，继续蒸至约2mL，将浓缩的提取液全部吸入5mL一次性注射器中，接上处理好的固相萃取小柱（临用前依次用5mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润），将提取液注入固相萃取小柱，然后依次用pH 8的水5mL及pH 8的甲醇－水（1∶1）5mL洗脱杂质，弃去洗脱液，再用盐酸－乙醇溶液（1∶9）4.5mL洗脱色素，洗脱液置于5mL量瓶中，用氨水调pH至中性，加水至刻度，摇匀，作为赤藓红供试品溶液。

2.4 HPLC系统适应性试验

流动相：以0.02mol／L乙酸铵溶液（含0.2%三乙胺，冰醋酸调pH至4.0）为流动相A，甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱。柱温30℃，检测波长254nm，DAD检测器波长范围210～700nm。分别取对照品混合溶液、模拟阳性样品供试品溶液和不含色素的阴性样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。各色素峰与相邻色谱峰分离完全，阴性样品溶液色谱在与对照品色谱相应位置处无色谱峰出现，详见图1～图7。

表1 梯度洗脱条件

图1 混合对照品色谱

图2 模拟阳性样品色谱（聚酰胺纯化）

图3 模拟阳性样品色谱（SPE小柱纯化）

图4 阴性样品色谱

图5 胭脂红光谱

图6 诱惑红光谱

图7 赤藓红光谱

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

分别精密吸取3种色素的标准贮备液各2μL注入液相色谱仪，按2.4中的条件测定，记录各色素峰保留时间。取2.1中的混合标准品溶液，精密吸取5，10，20，30，40μL注入液相色谱仪，测定、记录各色素峰面积，以峰面积为纵坐标，色素质量（ng）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。线性回归方程分别为Y＝3099.4X－7859.9，r＝1.00（胭脂红）；Y＝1880.7X－3491.9，r＝1.00（诱惑红）；Y＝1965.9X－5512.0，r＝1.00（赤藓红）。表明3种色素质量分别在50.02～400.12，53.24～425.96，51.90～415.22ng范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5.2 检出限的测定

精密吸取混合标准品溶液1mL，置于25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取10mL，置于25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成检出限供试溶液。胭脂红浓度为0.1600μg／mL，诱惑红浓度为0.1704μg／mL，赤藓红浓度为0.1661μg／mL。精密吸取供试溶液0.5，0.8，1.0，1.5，2.0μL及混合标准溶液20μL注入液相色谱仪，按2.4中的色谱条件进行测定，记录相应保留时间处3种色素的峰高，与噪音峰高相比，记录信噪比为3∶1时的进样量，计算检出限。结果胭脂红、诱惑红进样量为0.8μL，赤藓红进样量为1.0μL时信噪比约为3∶1，得出胭脂红的检出限为0.1ng，诱惑红的检出限为0.1ng，赤藓红的检出限为0.2ng。本方法的最低检出浓度为胭脂红0.03mg／kg，诱惑红0.04mg／kg，赤藓红0.04mg／kg。

2.5.3 精密度试验

取蘸料及火锅底料的模拟阳性供试品各2g，分别按2.3.1或2.3.2中的方法制备1份供试品溶液，连续进样6次，进样量10μL，测定峰面积，各色素峰面积的RSD分别为0.58%（胭脂红）、0.70%（诱惑红）、1.1%（赤藓红），表明方法及仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验

取蘸料及火锅底料的模拟阳性供试品6份各2g，精密称定，按2.3.1或2.3.2中的方法平行处理6份供试品溶液，分别进样10μL，测定峰面积，按外标一点法计算模拟阳性样品中3种色素的含量，结果蘸料样品中胭脂红含量为21.24mg／kg（RSD＝0.77%），诱惑红含量为25.55mg／kg（RSD＝0.98%），赤藓红含量为12.05mg／kg（RSD＝2.0%）；火锅底料样品中胭脂红含量为16.16mg／kg（RSD＝2.0%），诱惑红含量为19.19mg／kg（RSD＝4.0%），赤藓红含量为18.90mg／kg（RSD＝1.2%），表明该方法重复性良好。

2.5.5 回收率试验

根据模拟阳性样品的含量制备加标溶液。精密称取胭脂红标准品0.01394g、诱惑红标准品0.01718g，同置于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取2mL，置于10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为蘸料中胭脂红、诱惑红回收率加标溶液；精密称取赤藓红标准品0.01405g，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置于10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为蘸料中赤藓红回收率加标溶液。精密称取胭脂红标准品0.01786g、诱惑红标准品0.01549g、赤藓红标准品0.01690g，同置于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取1mL，置于10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为火锅底料回收率加标溶液。取匀浆后的蘸料模拟阳性样品9份各2g、火锅底料模拟阳性样品9份各1g，精密称定，分别精密加入各回收率加标溶液0.8，1.0，1.2mL，按2.3.1或2.3.2中的方法制备回收率供试溶液，测定各色素的含量（μg），计算回收率，结果见表2和表3。

表2 蘸料中3种色素的回收率（n＝9）

表3 火锅底料中3种色素的回收率（n＝9）

3 结论

经方法学验证，该方法精密度高，定量准确，重现性好，可操作性强，方法可靠，能够对蘸料和火锅底料中上述3种合成色素进行较准确的测定，可用于蘸料和火锅底料中人为添加合成色素的检测，以对其质量及安全做出有效控制。

4 讨论

市售蘸料和火锅底料多为红色或类红色，故选取胭脂红、诱惑红、赤藓红3种色素作为监测指标。

蘸料与火锅底料种类多样，且存在固体、液体、水、油等多种形态，故样品前处理中，须严格进行脱脂、混匀等过程，以保证结果的准确可靠。

胭脂红和诱惑红在酸性条件下能与聚酰胺牢固吸附，并能在碱性条件下轻易洗脱，故选用聚酰胺纯化样品中的胭脂红和诱惑红；而赤藓红不能与聚酰胺良好吸附，故选用SPE小柱纯化样品中的赤藓红。

样品前处理经过多次试验，证明聚酰胺或SPE小柱除杂质、提纯为必需步骤，否则供试品色谱中杂质峰过多，对色素峰的检测影响较大；供试品溶液最后不可用滤纸或微孔滤膜过滤，否则提取出的色素将被吸附，影响最终实验结果。

流动相中加入三乙胺改变色谱柱性质，可明显改善色谱峰拖尾现象。

参考相关文献，选取紫外区254nm作为3种色素的共同检测波长，也可根据3种色素的特征光谱，分别选取可见区最大吸收波长作为其检测波长。

蘸料和火锅底料中杂质较多，样品色谱中可能出现杂质峰，如果样品色谱与3种色素对照品色谱相同，保留时间处出现色谱峰，可用3种色素的特征光谱进行确认。查看该物质的光谱，与相应对照品光谱比对，如光谱一致，则确认检出色素，反之则可以排除。

［1］葛宇.食品中人工合成色素使用法规及检测标准进展［J］.质量与标准化，2011（9）：31－35.

［2］GB／T 5009.35－2003，食品中合成着色剂的测定［S］.

［3］GB／T 21916－2008，水果罐头中合成着色剂的测定高效液相色谱法［S］.

［4］张兰天，王红，王利军，等.高效薄层色谱法同时快速检测饮料中26种人工色素的研究［J］.食品工业，2014，35（8）：238－242.

［5］李晓芹，徐振东.固相萃取－高效液相色谱法在食品中合成着色剂检测中的应用［J］.食品工业，2014，35（6）：56－58.

［6］顾宇翔，葛宇，印杰，等.饮料和糖果中32种水溶性色素的HPLC筛选性检测［J］.食品工业，2012，33（8）：142－145.

Simultaneous HPLC－DAD Determination of 3 Synthetic Pigments in Dip and Hotpot Condiment

PANG Xiu－qing，MA Ying，QIU Hong－yan，WU Xi，ZHAO Li，LI Zexiaqiong
（Guizhou Institute for Food and Drug Control，Guiyang 550004，China）

Objective：To establish a HPLC－DAD method to determine the carmine，allura red and erythrosine in dip and hotpot condiment.Methods：Agilent Eclipse XDB－C18column is used，with 0.02mol／L ammonium acetate solution（containing 0.2%triethylamine，adjust glacial acetic acid pH to 4.0）and methanol as the mobile phase，gradient eluting.The HPLC－DAD method is applied.Simulated positive samples are prepared and methodology investigation is implemented.Petroleum ether is used to defat the samples，and anhydrous ethanol－2%ammonia－water（7∶2∶1）is used as the extracting agent to extract the pigments from the samples，and then the polyamide and SPE column are used for impurity removal and purification.The spectra of 3kinds of pigments are used to confirm suspected substances.Results：The mass of the pigments shows good linear relation with the peak area in the scope of 50.02～400.12，53.24～425.96，51.90～415.22ng.The recoveries of the pigments in dip and hotpot condiment are all above 97%，and theRSDs are all below 2.0%.The lowest detection limits of the method are 0.1ng for carmine，0.1ng for allura red and 0.2ng for erythrosine.Conclusion：This method is precise，reproducible，accurate，and could effectively monitor 3kinds of pigments added in dip and hotpot condiment.

HPLC－DAD；dip；hotpot condiment；synthetic pigment；solid－phase extraction（SPE）

TS264.4

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.034

1000－9973（2017）04－0149－05

2016－10－16

贵州省食品、保健食品、化妆品监测检测平台（黔科平台［2012］4001）

庞秀清（1987－），女，四川达州人，主管药师，硕士，研究方向：食品、药品、化妆品检验及质量标准。