季节和制曲位置变化对大曲生产影响的研究

吴秋霞，黄钧，吴重德，周荣清，2，3＊

（1.四川大学轻纺与食品学院，成都 610065；2.皮革化学与工程教育部重点实验室，成都 610065；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

季节和制曲位置变化对大曲生产影响的研究

吴秋霞1，黄钧1，吴重德1，周荣清1，2，3＊

（1.四川大学轻纺与食品学院，成都 610065；2.皮革化学与工程教育部重点实验室，成都 610065；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

描述了采用代谢产物分析及大曲微生物群落多样性评估等多尺度的方法，研究不同季节和制曲位置对大曲生产影响的结果。夏、秋季节和曲房不同位置的大曲微生物群落多样性差异显著，秋曲底物的水解活性及发酵力高于夏曲是真菌生物量增高所致。分离株及共培强化的秋曲中酯类和芳香族类组分的含量高于夏曲的，目标产物四甲基吡嗪（TTMP）的含量也是秋曲高于夏曲，且中央区域大曲高于曲房周边曲的，但4－乙基愈创木酚（4－EG）含量则是夏曲的较高，且曲房周边的曲较高。共培养强化秋曲的TTMP含量较对照曲高12倍，而夏曲的4－EG含量也提高了9.6倍。

强化大曲；季节；制曲位置；理化性质；挥发性组分；微生物群落

1 概述

中国传统白酒的生产过程中，大曲参与了底物水解、初级与次级代谢产物的代谢，并因大曲质量和风味与基酒的质量和特色密切相关而被誉为“酒之骨”［1，2］。大曲的生产特点是自然接种，生料制曲，其小生境的温度、湿度、栖息微生物群落多样性以及品温、湿度的控制对其质量的影响显著［3－5］。大曲微生物群落构成复杂，可培养方法难以揭示群落多样性以及微生物与大曲活力之间的相关性，生产工艺也滞留在师传身授的传统模式。二十多年来，分子生物学理论与技术的迅速发展促进了对酿酒大曲微生物群落的构成特征和多样性的深入研究［6－8］。Zhang等应用巢式PCR技术比较了3种大曲间主要群落的异同，为开发特定功能强化大曲的生产技术奠定了重要基础［9］。Han等应用高通量测序技术对春、夏季大曲的群落多样性、水解活性及挥发性组分异同的研究结果表明：原核生物的分类操作单元（OUT）较真核生物的多，桃花曲（春曲）真菌群落构成较伏曲（夏曲）的复杂，致使其液化力和糖化力更强，且挥发性组分更丰富［10］。从酿酒中间产品中筛选功能菌及开发强化大曲的生产新技术逐渐被视为改善酿酒大曲和控制大曲代谢产物的重要途径。Wu等以源于糟醅的分离菌株构建工程菌，开发了改善其淀粉水解活力和发酵力的强化大曲，有效提高了产酒率［11］。陈雪玲等也进行了类似的研究，根据生产复合大曲的主要理化性质（糖化力、液化力、发酵力、酯化力等）获得了多菌株共培强化的优化条件［12］。从理化指标、感官性质、群落多样性及挥发性组分等多尺度评估大曲质量的优劣，将有助于揭示大曲在白酒酿造过程中的关键贡献，同时科学地指导大曲生产工艺的优化。

本文描述了基于理化性质、微生物群落、挥发性组分及指纹图谱等不同尺度评估季节、制曲位置对大曲质量的影响。针对基于TTMP高产分离株Bacillus velezensis M－14和4－EG高产分离株B.subtilis D－31及共培条件生产强化大曲，同时研究了对四甲基吡嗪（TTMP）和4－乙基愈创木酚（4－EG）目标产物含量的影响。研究结果有益于认识季节、小生境条件对分离株及共培强化大曲特性的影响，为强化大曲工艺条件的优化有借鉴作用。

2 材料与方法

2.1 微生物及培养基

Bacillus subtilis D－31，Bacillus velezensis M－14：分别分离自酱香型和浓香型大曲，经形态、生理生化及16SrDNA测序结果鉴定，保藏于本实验室。

菌种保藏及活化培养基：固体营养肉汤培养基。

种子培养基：Bacillus velezensis M－14：营养肉汤培养基；Bacillus subtilis D－31：可溶性淀粉27.70g／L，KCl 6.66g／L，酵母膏50g／L，起始pH调至8.0。

固态发酵培养基：大曲坯料。

2.2 主要试剂

四甲基吡嗪 阿拉丁公司；4－乙基愈创木酚标品英国Alfa Aesar公司；2－辛醇、辛酸及其甲酯 Sigma公司；其他化学试剂购于本地化学商品试剂供应商，均为分析纯。

2.3 主要仪器与设备

气相色谱－质谱联用仪，TR－5MS毛细管色谱柱Thermo Fisher公司（美国）；QYC－2112恒温振动培养器 福玛有限公司（上海）。

2.4 实验方法

强化种子液的制备：从B.subtilis D－31和B.velezensis M－14斜面上分别挑取2～3环接种到装有50mL营养肉汤培养基的250mL三角瓶中，摇瓶培养12h（37℃，120r／min）至对数前期，然后分别以3%（V／V）和6%（V／V）的量接种到装有250mL种子培养基的500mL三角瓶中，摇瓶培养24h（37℃，120r／min）。

混合菌液的制备：将D－31和M－14两菌株的种子液调整到大致相同的浓度（107cfu／mL），然后以M－14∶D－31为3∶7的比例混合制得菌悬液。

分离株和混合菌悬液均以0.2%（V／m）的量接种到大曲坯料中，在宜宾叙府酒业制曲车间生产强化大曲。

2.5 分析检测方法

2.5.1 理化指标的检测

参照文献［13，14］中所述方法检测大曲的水分、酸度、发酵力、酯化力、糖化力以及液化力。

2.5.2 基于PLFA指纹图谱技术对微生物群落多样性的评估

［15，16］所述的方法，应用基于PLFA生物标记指纹图谱方法评估大曲样品的微生物群落多样性特征。

2.5.3 基于HS－SPME／GC－MS技术检测大曲挥发性组分

称取1g大曲样品，加入10μL内标溶液，置于20mL顶空瓶中，在60℃恒温水浴锅中预平衡15min后，插入固相微萃取针头萃取45min，再将萃取头插入GC－MS进样口解吸3min，进行GC－MS分析［17］。

3 结果与讨论

3.1 季节对大曲理化性质的影响

季节对大曲理化指标的影响见表1。

表1 季节对大曲理化指标的影响Table 1 Effects of different seasons on physicochemical properties of Daqu

由表1可知，各季节强化大曲的理化性质都优于对应的空白曲。分离株及共培强化大曲的酸度因菌相间的竞争抑制了环境和原料携带的产酸菌的生长繁殖而降低，而糖化、液化力提高显著。酯化力和发酵力则略有差异。B.subtilis D－31分离株强化的秋曲的酯化力和发酵力低于对照样的。夏季昼夜间气温、湿度差小，对照样和强化曲样的各种活性指标低于秋曲的。而秋季气温相对较低，昼夜间温湿度差较大，前期升温缓慢，生产过程的温湿度容易控制，有益真菌生长繁殖，所以相应活性参数高于夏曲的。

3.2 季节对目标组分及挥发组分的影响

对强化大曲的目标组分TTMP和4－EG的含量检测结果（见图1）表明；强化大曲的TTMP，4－EG含量较对照样品高。季节变化对TTMP含量的影响类似理化性质的结果，秋曲中的含量高于夏曲的，秋季共培强化曲（Q2）中TTMP的含量较对照曲（Q0）的增加了10.93倍，且是夏曲（X2）的10.27倍。而4－EG的含量则是夏曲的较高，夏季共培强化曲（X2）较对照曲（X0）增加了8.56倍，是秋曲（Q2）的4.91倍。

图1 季节对大曲特征组分的影响Fig.1 Effects of different seasons on characteristic components of Daqu

由检测不同季节大曲挥发性组分的结果（见表2）可知，在5类组分中，优势组分是芳香族类和酯类。B.subtilis D－31能有效地将阿魏酸（FA）转化为4－EG等酚类，而B.velezensis M－14能高效地合成吡嗪类［18］，且分离株具有较强的分泌水解酶（淀粉酶、酯化酶）的能力，培养过程中酯类合成能力较强，因此强化曲酯类组分含量较对照曲高，夏秋两季共培强化曲分别是对照曲的2.94倍和2.73倍。鉴于上述小生境变迁的原因，强化秋曲的芳香族、酯类及吡嗪类组分含量均高于对应的夏曲。季节间对照样挥发性酸类组分与其他类组分含量变化不显著，但强化方式因季节不同差异显著。共培强化与分离株夏曲的酸类组分显著低于对照，但其他类组分则更高。然而，仅共培强化秋曲的酸类组分含量显著低于对照组，分离株强化曲与相应的对照曲差异不显著，共培及B.velezensis M－14分离株强化曲的其他类组分含量高于对照组，但B.subtilis D－31分离株强化曲则低于对照组。可能是强化菌株的参与对原群落产生干扰，改变了代谢及产物积累途径所致，其机理有待进一步探讨。

表2 季节对大曲挥发性组分的影响Table 2 Effects of different seasons on volatile components of Daqu ng／g

3.3 季节对大曲微生物群落多样性的影响

夏曲和秋曲分别检出了11种和12种PLFAs（见图2），其含量在各强化曲中差异不显著。进一步评估强化方式、季节对微生物群落多样性影响的结果（见表3）表明：强化曲G＋／G－和细菌／真菌的值较对照曲都有不同程度的增高，这是因为用于强化的分离菌株D－31和M－14皆属G＋菌，且耐高温，在生产过程中有竞争优势。微生物群落多样性特征评估的结果佐证了夏曲细菌／真菌的值高，夏季气温较高，适合产酸细菌的繁殖，从而导致大曲酸度较高，秋曲真菌生长繁殖较旺盛，发酵力增高的推测（见表1）。同时试验结果也揭示酯类、芳香族类组分的含量与真菌含量密切相关。

图2 不同季节大曲中PLFA的种类与含量Fig.2 PLFA types and content of Daqu in different seasons

表3 不同季节大曲中微生物群落多样性特征Table 3 Characteristics of microbial community diversity of Daqu in different seasons

3.4 空间位置对大曲各参数的影响

将同期制作的强化大曲分别放置于同一间曲房的四周和中央区域进行培养，检测大曲的理化指标，结果见表4。

表4 空间位置对大曲理化指标的影响Table 4 Effects of locations on physicochemical properties of Daqu

由表4可知：曲块放置对其有较大的影响。曲房中央大曲的水分和酸度高于曲房四周的大曲，这是由于中央区域通风、排潮不畅，温、湿度控制滞后于曲房周边环境，但中央大曲的发酵力和酯化力较低。结果揭示了温度和湿度控制对强化大曲的质量也有显著的影响。

考察位置对目标组分含量影响的结果（见图3）表明：同一曲房不同区域的微环境存在较大差异，致使大曲TTMP和4－EG的含量增幅各异，曲房周边大曲的4－EG含量高于中央区域的，对TTMP含量也类似。微环境的差异对目标产物含量因分离株和强化方式而异。B.subtilis D－31强化，则在中央区域大曲的4－EG含量增幅最大，为对照曲的11倍，而四周的共培强化曲TTMP的含量是对照样的2.8倍。由此可见，共培强化、降温迅速、排潮快均有益于TTMP含量的提高，反之B.subtilis D－31强化，有利于4－EG含量的提高，这些目标产物的含量可能与温、湿度、供氧速率有关［19］。

图3 位置对大曲挥发性组分的影响Fig.3 Effects of locations on volatile components of Daqu

不同空间位置的大曲检出的12种PLFA组分及含量见图4。

图4 不同位置大曲中PLFA的种类与含量Fig.4 PLFA types and content of Daqu in different locations

相应的G＋菌、G－菌、细菌和真菌组成特点见表5。

表5 不同位置大曲的微生物群落多样性特征Table 5 Characteristics of microbial community diversity of Daqu in different locations

对于自然制曲，中央区域大曲的G－菌和真菌生物量低于对应周边大曲的，细菌及G＋菌略占优势。在两个区域的分离株强化曲的G＋菌的生物量增加，但仅有中央区域曲的G＋／G－的值显著增高，曲房四周区域的则几乎相同，细菌总的生物量也有类似的变化。两个区域的B.velezensis M－14分离株与共培强化曲的真菌生物量增高，但B.subtilis D－31强化曲中真菌生物量略有减少，其原因有待进一步探究。

4 结论

以理化性质、基于PLFA的大曲微生物群落多样性评估及挥发性物质组成等参数对夏、秋强化大曲的研究结果表明：季节和制曲小生境对大曲群落多样性影响较大，秋曲的底物的水解活性及发酵力高于夏曲，其主要贡献是真菌生物量增高所致。分离株及共培强化秋曲的酯类、芳香族类组分的含量高于夏曲的，目标产物的TTMP含量也高于夏曲，且曲房中央区域的曲高于周边的曲，但4－EG的含量则夏曲较高，曲房周边的曲较高。

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Study on the Effect of Season and Koji－making Location on Daqu Production

WU Qiu－xia1，HUANG Jun1，WU Chong－de1，ZHOU Rong－qing1，2，3＊
（1.College of Light Industry，Textile ＆Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China；2.Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering，Ministry of Education，Chengdu 610065，China；3.National Solid Fermentation Engineering Research Center，Luzhou 646000，China）

Use analysis of metabolites，PLFA method and other ways to explore the effect of season and kojimaking location on Daqu production.The results show that different seasons and koji－making locations cause obvious differences of microbial community diversity，and it indicates that the increasing fungal biomass makes hydrolytic activity and fermentation power of Daqu made in autumn higher than that of Daqu made in summer.The content of esters and aromatics in fortified Daqu made in autumn is higher than that of Daqu made in summer，so does TTMP，and compared with Daqu around koji－making plant，the content of TTMP in central area is higher.However，Daqu made in summer and located around koji－making plant has more 4－EG.The content of TTMP in fortified Daqu by co－culturing made in autumn increases 12times compared to the control sample，and the content of 4－EG in fortified Daqu by co－culturing made in summer increases 9.6times.

fortified Daqu；season；location；physicochemical property；volatile components；microbial community

TS261.11

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.010

1000－9973（2017）04－0042－05

2016－10－15 ＊通讯作者

吴秋霞（1991－），女，硕士，研究方向：现代发酵技术；周荣清（1960－），男，教授，博士生导师，博士，研究方向：发酵工程与生物化工。