慢性缺氧大鼠心肌HSP47 mRNA的表达及其与PⅠCP和PⅢNP含量的相关性研究

林梦娇，田倪妮，魏 玲*，朱向情，杨晓华，田 青，曹 帅，阮光萍，潘兴华*

(1昆明总医院地方干部病房，昆明 650032；2昆明市第一人民医院心内科，昆明 650011；3云南省干细胞工程实验室，昆明 650032)

慢性缺氧是多种心血管疾病及心室重的诱因，是发病的重要环节，尤其对于老年患者，慢性缺氧可致多种心血管疾病[1，2]。热休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)是一种高度保守的分子蛋白，既往研究表明其是胶原的特异性分子伴侣，在胶原分泌、合成及其所致纤维化中起重要作用。慢性缺氧可引起明显的肺动脉高压以及右心室重构，甚至最终发展为心力衰竭[3，4]。本研究通过建立慢性缺氧SD大鼠模型，测定HSP47 mRNA表达量及Ⅰ型前胶原C端原肽(procollagen Ⅰ C-propeptide, PⅠCP)及Ⅲ型前胶原N端原肽 (procollagen Ⅲ N-propeptide，PⅢNP)的含量，探讨其与心肌纤维化的相关性。

1 材料与方法

1.1 低氧环境的建立和依据

参考Bonnet等实验[3-5]改良缺氧箱。缺氧箱箱体系统主要由动物饲养箱体和箱内气路组成。氧气浓度控制系统由高压氮气气瓶、电磁阀、氧浓度控制器、气体流量控制器组成，置于箱体的上部。设置箱体内的氧浓度后，整个系统由氧气浓度控制系统自动控制。智能控氧仪位于箱体上部，实时检测箱体内氧含量，并显示在智能控氧仪屏幕上，当箱体内氧浓度高于设置值时，电磁阀开启，充氮气进入箱体，充气速度由气体流量计控制，当氧浓度低于设定值时电子阀自动关闭，停止氮气输入。使箱体内氧气浓度保持在一定范围内。

1.2 实验动物分组

40只SPF级的雄性SD大鼠适应性正常饲养1周，按随机数字表完全随机分为5组，每组8只。对照组不给于缺氧处理(A组)。各慢性缺氧组大鼠放入缺氧箱中，向箱中快速通入氮气, 控制气流流量(0.09～0.1)m3/h，箱内氧气浓度从20.95%开始下降，控制氧浓度为10%±0.5%，分别缺氧 7 d(B组)、14 d(C组)、21 d(D组)、28 d(E组)。每天早上8∶00～8∶30开箱放气，清理粪便，补给食物和水，其他时间模型组大鼠均饲养于缺氧箱中。

1.3 实验方法

1.3.1 心肌组织总RNA的提取 从-80℃冰箱中取出心肌组织，移到液氮预先冷却的研钵中，边加液氮边研磨至样品成白色粉末。待液氮挥发完后，加入2 ml Trizol(Takara,9109)。将变成固体的Trizol研磨成粉末。继续研磨至Trizol恢复成液体。将所得液体转移入离心管。按Trizol说明书提取总RNA。将所得样本的RNA分别移放置入RNase free离心管中，将离心管标记后放入-80℃冰箱中冻存。

1.3.2 逆转录获取cDNA 在200 μl薄壁聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)管中配制RT混合反应液，反应体系20 μl。在PCR仪上按照下面条件进行逆转录(reverse transcription, RT)： 25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃孵化，最终可得到cDNA，并放入-20℃冰箱冻存。

1.3.3 引物的设计与合成 根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)Genebank中大鼠HSP 47的基因序列以及beta-actin内参序列，用Primer premier 5.0引物设计软件设计出特异性高的引物序列。该引物的合成由昆明贝尔吉有限公司合成。引物片段约115 bp。

表1 目的基因及内参引物Table 1 The primers of target gene and beta-actin

1.3.4 实时荧光定量PCR反应 目的基因HSP47的扩增条件： 20 μl反应体系，行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-PCR)反应，50℃ 2 min起始模板变性，95℃ 3 min模板变性(循环数1)；95℃ 10 s退火，55℃ 1 min延伸(循环数38)；72℃ 5 min延伸(循环数1)；65℃ to 95℃制作溶解曲线。收集数据，测定样品各管的Ct值，设定无cDNA样品作为对照管。

1.3.5 患者血清中PⅠCP浓度的测定 采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测本组40只SD大鼠血清中PⅠCP、PⅢNP浓度。将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，先后加入受检标本、酶标抗体，最后加底物显色。用酶标仪检测。

1.3.6 HE和MASSON组织切片染色 用HE和MASSON染色法对对照组及慢性缺氧组大鼠心肌组织进行切片染色，观察镜下改变。

1.3.7 HSP47 mRNA相对表达量的计算方法 本实验采用定量PCR中的公式法进行相对定量，实时连续测定基因扩增过程中产生的荧光，以达到指数扩增时的循环周数(Ct)值进行校正。方法如下：用下列公式计算各组大鼠的HSP47 mRNA相对表达量，以beta-actin作为对照，A组作为基准，其余各组作为目的基因，目的基因mRNA的表达量均表达成基准的N倍(N=2-△△Ct)，其中△Ct= Ct(目的基因)- Ct(beta-actin)，△△Ct=△Ct样品-△Ct基准。各组△Ct的比较间接反映出各组真实拷贝数间的关系，各样本Ct值越大，说明目的基因拷贝数越少。重复3次取Ct平均值。本实验中，Bio-rad CFX96自带程序计算方法同上，获得目的基因的相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析或 Tamhane 方差分析。两组间比较采用t检验，相关性分析采用 Pearson 直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 目的基因荧光定量PCR产物鉴定

目的基因HSP47 mRNA引物片段长度为115 bp,beta-actin引物片段长度为135 bp左右。基因条带无引物二聚体且清晰无杂带(图1)，因此引物的设计合理，PCR引物及扩增产物特异性高。

图1 热休克蛋白47mRNA扩增产物Figure 1 Heat shock protein 47 mRNA amplification product

2.2 HSP47 mRNA在不同实验分组心肌中的相对表达量

与对照组比较，模型C组、D组、E组的HSP47 mRNA表达量明显增多(P<0.01)， 模型B组HSP47 mRNA表达量无明显差异(P>0.05)。亚组间两两比较：与B组比较，C组、D组、E组的HSP47 mRNA表达量明显增多(P<0.01)；与C组比较，D组、E组的HSP47 mRNA表达量明显增多(P<0.01)；与D组比较，E组的HSP47 mRNA表达量明显增多(P<0.01)。

图2 热休克蛋白47 mRNA在不同缺氧组心肌中的相对表达量Figure 2 Relative expression of heat shock protein 47 mRNA in different hypoxia groups

A: control group; B: chronic hypoxia for 7 d; C: chronic hypoxia for 14 d; D: chronic hypoxia for 21 d; E: chronic hypoxia for 28 d. Compared with group A,**P<0.01； compared with group B,##P<0.01; compared with group C,△△P<0.01； compared with group D,▲▲P<0.01

2.3 ELISA法检测血清及心肌中的PⅠCP和PⅢNP浓度

与对照组比较，模型B组、C组、D组、E组的血清、心肌组织PⅠCP、PⅢNP含量明显增多(P<0.01)。亚组间两两比较：与B组比较，C组、D组、E组的血清、心肌组织PⅠCP、PⅢNP含量明显增多(P<0.01)；与C组比较，D组、E组的血清、心肌组织PⅠCP、PⅢNP含量明显增多(P<0.01)；与D组比较，E组的血清、心肌组织PⅠCP、PⅢNP含量明显增多(P<0.01；表2)。

2.4 心肌HSP47mRNA与血清、心肌的PⅠCP和PⅢNP相关性分析

心肌HSP47mRNA与血清和心肌的PⅠCP、PⅢNP呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05；表3)。

2.5 心肌组织HE染色和MASSON染色

正常心肌细胞在HE染色和MASSON染色下(图3A，3B)呈短柱状，细胞核呈椭圆形、深染、染色质均匀。慢性缺氧大鼠HE染色下(图3C,3D)心肌细胞弥漫空泡变，心肌间质广泛纤维化。MASSON染色下胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。

表2各组大鼠血清和心肌的PⅠCP和PⅢNP浓度的比较

GroupSerumPⅠCPPⅢNPMyocardiumPⅠCPPⅢNPA69．25±8．171．16±0．01153．66±7．613．85±0．02B78．32±10．001．17±0．01160．41±1．743．85±0．01C95．10±9．59∗∗##1．51±0．02∗∗##181．50±10．84∗∗##4．10±0．01∗∗##D115．85±9．16∗∗##△△1．83±0．01∗∗##△△216．15±11．50∗∗##△△4．24±0．01∗∗##△△E235．64±10．43∗∗##△△▲▲2．48±0．02∗∗##△△▲▲279．78±6．54∗∗##△△▲▲5．05±0．02∗∗##△△▲▲

PⅠCP: procollagen Ⅰ C-propeptide; PⅢNP: procollagen Ⅲ N-propeptide. Compared with group A,**P<0.01； compared with group B,##P<0.01； compared with group C,△△P<0.01； compared with group D,▲▲P<0.01

表3 心肌HSP47 mRNA与血清和心肌的PⅠCP和PⅢNP相关性分析Table 3 Correlation analysis of cardiac HSP47 mRNA and PⅠCP and PⅢNP in serum or myocardium

PⅠCP: procollagen Ⅰ C-propeptide; PⅢNP: procollagen Ⅲ N-propeptide; HSP47: heat shock protein 47

图3 大鼠心肌组织HE和MASSON染色Figure 3 HE staining and MASSON staining of myocardial tissue A: control group(HE ×200); B: control group(MASSON ×200); C: chronic hypoxia group(HE ×400); D: chronic hypoxia group (MASSON ×400)

3 讨 论

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是指心肌正常组织结构中出现的以细胞增殖、细胞外基质过度沉积为主要表现的疾病[5，6]。心肌过量纤维化是心室重构的重要标志，心肌纤维化导致心脏僵硬度增加、心脏顺应性降低，心脏传导阻滞，心脏收缩及舒张功能障碍，最终导致心力衰竭发生[7，8]。细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)是由Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原、Ⅵ型胶原构成，其中以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原为主[9]。 心肌胶原中含Ⅰ型胶原约80%，因其纤维比较粗、僵硬度很大以及抗牵拉功能较强，从而在维持室壁强度上起重要的作用。心肌胶原中含Ⅲ型胶原约11%，Ⅲ型胶原的纤维比较细，且其弹性和伸展性比较好。在维持心肌组织正常结构和心脏功能完整性方面，Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比例具有很重要的意义[6]。研究表明[10，11]。PⅠCP C基末端肽可作为Ⅰ型胶原蛋白合成的标志物，PⅢNP N基末端肽可作为Ⅲ型胶原蛋白合成的标志物，因此在实验中检测PⅠCP和PⅢNP 浓度就可反映胶原含量以及胶原合成和降解的情况，故PⅠCP和PⅢNP可成为MF重要的指标。HSP47作为热休克蛋白家族中唯一的胶原特异性分子伴侣，与胶原前体的加工、折叠、合成、分泌等过程密切相关，特别是与Ⅰ型胶原的分泌有关。HSP47与胶原合成密切相关，两者表达有时间和空间上的一致性[12]，这种一致性在培养细胞[13]、胚胎组织发育[14]和组织纤维化中均得到了证实。因此可通过观察HSP47 mRNA的表达量来间接反映心肌纤维化程度。所以通过检测血清、心肌的PⅠCP、PⅢNP的浓度、心肌HSP47 mRNA表达联合组织病理学(HE染色、Masson)检测可以反映出缺氧导致心肌纤维化的程度。

本研究应用ELISA法检测血清、心肌PⅠCP、PⅢNP的浓度，应用q-PCR技术检测各组大鼠HSP47 mRNA表达，结果发现：与对照组相比，模型组中的血清、心肌的PⅠCP、PⅢNP浓度和心肌HSP47 mRNA相对表达量均明显增多(P<0.01)；模型组内两两比较，血清、心肌的PⅠCP、PⅢNP的浓度和心肌HSP47 mRNA相对表达量均有明显的统计学差异(P<0.01)，且随缺氧时间增加而增多。对正常组大鼠和慢性缺氧组大鼠心肌组织做组织切片同样证实：正常心肌细胞在HE染色和MASSON染色下呈短柱状，细胞核呈椭圆形、深染、染色质均匀。慢性缺氧大鼠HE染色下心肌细胞弥漫空泡变，心肌间质广泛纤维化。MASSON染色下胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，胶原纤维连接呈网状。大量研究证明HSP47在胶原蛋白分泌细胞的内质网内与胶原特异性结合，参与胶原的折叠、装配、修饰和转运，与胶原合成密切相关，两者表达有时间和空间上的一致性[12]。本研究中HSP47 mRNA相对表达量与血清和心肌中PⅠCP、PⅢNP浓度均随缺氧时间的增加而增多，并且相关性分析显示，心肌HSP47 mRNA与血清和心肌的PⅠCP、PⅢNP、CVF呈高度线性正相关(P<0.05)，说明了HSP47 mRNA相对表达量与胶原合成一致，与朱慧等[15]的结果一致。HSP47 mRNA的表达量与胶原合成密切相关，可以间接反映心肌纤维化程度，提示HSP47作为心肌胶原分子伴侣在慢性缺氧心脏重构、心肌纤维化中起重要作用，为治疗缺氧所导致的心力衰竭提供了新的方法。

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