多菌种发酵生产微生物蛋白饲料的菌种筛选研究

李洋++李忠军

摘要 对茶粕固态发酵生产微生物蛋白饲料的菌种进行筛选试验。结果表明：茶粕接入霉菌和酵母菌组成的混合菌种进行发酵可获得较多的菌体干重，其中尤以黑曲霉、米曲霉、绿色木霉和产朊假丝酵母组成的混合菌种发酵茶粕获得的菌体干重最多，可达到20.55 g/L左右。因此，选用这4种菌种作为茶粕发酵生产微生物蛋白饲料的最优混合菌种。

关键词 茶粕；微生物蛋白饲料；固态发酵；霉菌；酵母菌

中图分类号 S816.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）05-0228-03

Abstract An research for producing microbial protein feed was conducted by solid state fermentation using oil-tea-cake.The dry weight of microbial cells by different mixed fermentations were studied. The results showed that the dry weight of microbial cells in oil-tea-cake by compound culture of microzyme and mildew was more than others.The best compound microbes was screened out，it included Aspergillus niger，Aspergillus oryzae，Trichoderma viride and Geotrichun candidum.When reaction time was 4 days，the dry weight of microbial cells in oil-tea-cake by the four microbes increased to 20.55 g/L.So the four microbes could be selected as the optimum compound microbes on producing microbial protein feed with oil-tea-cake.

Key words oil-tea-cake；microbial protein feed；solid fermentation；mildew；microzyme

我国是世界上油茶品种最多、分布最广、籽产量最高的国家，油茶籽、茶粕（即油茶籽榨油后剩下的渣）年产量分别为100万、73万t左右[1]。在我国江西、湖南等南方丘陵地区，油茶是一种重要的油料植物。

目前，我国茶粕大部分被用作清塘剂、肥料、燃料，甚至废弃，仅少量用于茶皂素的提取，造成了资源浪费，同时也污染了环境。茶粕中含有丰富的蛋白质、糖类、粗纤维、灰分和茶皂素，利用价值较高，目前利用茶粕开发饲料的研究受到普遍关注[2-3]。研究表明，茶粕纤维素含量较高，营养水平较低，以及茶粕中茶皂素等抗营养因子含量过高是限制油茶饼粕饲用的主要因素[4-5]。为使茶粕变废为宝，缓解目前我国蛋白饲料短缺的问题，本试验以去除茶皂素的油茶饼粕为原料，采用多菌种组成的混合菌种进行发酵，拟筛选出降低茶粕粗纤维含量、提高茶粕饲料适口性、增加茶粕菌体蛋白含量的优良菌种。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。白地霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、黑曲霉、米曲霉、绿色木霉，均由广东微生物研究所提供，依次用Y1、Y2、Y3、M1、M2、M3表示。其中，黑曲霉、米曲霉、绿色木霉能产生较丰富的纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等酶类，可较好地降解纤维素等多糖并产生较多的还原糖；产朊假丝酵母、白地霉、热带假丝酵母则有利用还原糖能快速生长的特点，可较大提高茶粕的菌体蛋白含量。通过不同菌群之间的组合，应当可以实现优势匹配和“超产”的目标[6-7]。

1.1.2 仪器与设备。超净工作台、恒温培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、移液器、电热恒温干燥箱、电动离心机、水浴锅、电炉、试管、量筒、烧杯、三角瓶、容量瓶等。

1.1.3 培养基。①斜面培养基。PDA培养基：用于霉菌培养；麦芽汁琼脂培养基：用于酵母菌培养。②液体种子培养基。霉菌：葡萄糖2%，可溶性淀粉3.0%，蛋白胨0.15%，KH2PO4 0.3%，（NH4）2SO4 0.5%，MgSO4 0.15%[8-9]，自来水1 000 mL。酵母菌：130 g麦芽汁加水1 000 mL配成12 oBx溶液，供酵母增殖用。

1.2 试验方法

1.2.1 茶粕固体发酵培养基。茶粕12.5 g，猪血粉2.5 g，（NH4）2SO4 2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.05%。

1.2.2 发酵条件。250 mL三角瓶，装茶粕固体发酵培养基15 g，加自来水20 mL，杀菌后接种经活化及扩大培养的6 种菌种的菌悬液（总接种量为15%，各菌种的接种比均为1∶1），在室温下培养4 d。

1.2.3 分析测定方法。培养结束后向三角瓶内加入蒸馏水200 mL，30 ℃恒温水浴浸提3 h，过滤，所得滤液用于测定菌体干重[6-8]。将滤液全部移入离心管中，3 000 r/min离心分离10 min，再分离出上清液，保留管底沉淀物，用蒸馏水洗涤此沉淀物3次[8-9]，收集到的即是微生物细胞。将微生物细胞置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，称重即为菌体干重。

2 结果与分析

2.1 单菌种发酵

用250 mL三角瓶装茶粕固体发酵培养基15 g，加水20 mL，灭菌后接种单一菌种的菌悬液（接种量均为15%），在室温下培养4 d。发酵结束后以收集到的菌体干重作为测试指标，试验结果见图1。可以看出，采用单一菌种发酵茶粕培养基，收集到的菌体干重很少，最多仅为9.35 g/L，这说明采用单一菌种发酵茶粕时，茶粕和猪血粉中的营养成分很难被利用，因而自身的生长繁殖受到影响[8-10]。为了大量培养菌种细胞，茶粕发酵时应当采用混合菌种进行发酵，有效利用微生物的协同作用，促使各菌种在茶粕基質中都能较好地生长繁殖[11-12]。

2.2 双菌种发酵

用250 mL三角瓶装茶粕固体发酵培养基15 g，加水20 mL，灭菌后接种双菌种的菌悬液（总接种量为15%，2种菌种的接种比为1∶1），在室温下培养4 d[13-14]。发酵结束后以收集到的菌体干重作为测试指标，试验结果见图2。可以看出，采用双菌种发酵茶粕培养基，发酵后收集到的菌体干重在9.43～13.74 g/L之间，大于单菌种发酵获得的菌体干重[9]，这是因为霉菌和酵母菌之间存在一种协同作用，霉菌能分泌淀粉酶、纤维素酶及蛋白酶等酶类，降解淀粉、粗纤维及粗蛋白等物质，生成可被酵母菌直接利用的葡萄糖、氨基酸等小分子物质，酵母菌则在这些小分子营养物质的作用下不断生长繁殖，使发酵后茶粕含有较多的菌体细胞。

2.3 三菌种发酵

用250 mL三角瓶装茶粕固体发酵培养基15 g，加水20 mL，灭菌后接种三菌种的菌悬液（总接种量为15%，3种菌种的接种比为1∶1∶1），在室温下培养4 d。发酵结束后以收集到的菌体干重作为测试指标，试验结果见图3。可以看出，采用三菌种发酵茶粕培养基，发酵后收集到的菌体干重为10.66～18.91 g/L，差别较大，其中混合菌种M3+Y1+Y2发酵茶粕后收集到的菌体干重可达18.91 g/L，菌体干重居首位，粗纤维含量也降低至10.54%，是三菌种发酵中最优的菌种组合。

2.4 四菌种发酵

用250 mL三角瓶装茶粕固体发酵培养基15 g，加水20 mL，灭菌后接种四菌种的菌悬液（总接种量为15%，4种菌种的接种比为1∶1∶1∶1），在室温下培养4 d。发酵结束后以收集到的菌体干重作为测试指标，试验结果见图4。可以看出，4种菌种组成的混合菌种能更好地利用培养基中的营养成分来维持各菌种细胞的生长繁殖，四菌种发酵可获得的菌体干重总体上多于双菌种发酵及三菌种发酵。

2.5 五菌种发酵

用250 mL三角瓶装茶粕固体发酵培养基15 g，加水20 mL，灭菌后接种五菌种的菌悬液（总接种量为15%，5种菌种的接种比为1∶1∶1∶1∶1），在室温下培养4 d。发酵结束后以收集到的菌体干重作为测试指标，试验结果见图5。可以看出，采用五菌种发酵茶粕培养基，发酵后收集到的菌体干重要比四菌种发酵低，这说明多菌种发酵时，并非菌种越多越好。因为菌种数增多，会消弱各菌种的优势，且容易感染杂菌[8-9]，使培养的目的菌种不能较好地生长繁殖，故导致菌体干重减少。

2.6 六菌种发酵

用250 mL三角瓶装茶粕固体发酵培养基15 g，加水20 mL，杀菌后接种六菌种的菌悬液（总接种量为15%，6种菌种的接种比为1∶1∶1∶1∶1∶1），在室温下培养4 d。发酵结束后以收集到的菌体干重作为测试指标，复合菌种M1+M2+M3+Y1+Y2+Y3发酵茶粕收获菌体干重为14.66 g/L。可知6种菌种组成的混合菌种不适宜用来发酵茶粕，这是因为采用六菌种发酵茶粕培养基，发酵后收集到的菌体干重较少，而粗纤维含量也较高[9-10]。

3 结论与讨论

本试验在所选用的菌种范围内进行了广泛的筛选，试验结果表明，茶粕培养基在接入不同混合菌种进行发酵后，都能获得一定的菌体干重（或菌体蛋白）。但是菌体干重的含量差别较大，在6.57～20.55 g/L范围内变化，其中3种霉菌和1种酵母菌组成的混合菌种获得菌体干重最多[8-10，13-14]，尤以混合菌种M1+M2+M3+Y2获得的菌体干重较多，可达20.55 g/L左右，故该混合菌种是发酵茶粕和血粉生产微生物蛋白饲料的最佳菌种组合。

4 参考文献

[1] 杨强，胡海波，张石蕊，等.茶粕饲料资源开发及利用技术研究进展[J].饲料工业，2006（1）：53-55.

[2] 杨洪国，李智勇，张德成.我国木本粮油产业发展现状及对策分析[J].西南农业学报，2010，23（6）：2114-2119.

[3] 周薇，吴雪辉.油茶综合利用开发前景[J].中国农村科技，2006（10）：21-23.

[4] 王慧杰，李自刚，辛婷，等.多菌种混合发酵玉米秸秆生产含酶蛋白饲料的研究[J].湖南农业科学，2011（7）：125-128.

[5] ROSES R P，GUERRA N P.Optimization of amylase produc-tion by Aspergillums niger in solid-state fermentation us-ing sugarcane bagasse as solid support material[J].World Journal of Microbiology & Biotechnol-ogy，2009，25（11）：1929-1939.

[6] 张伟心，马艳玲，霍玉鹏.混合菌发酵玉米秸秆生产菌体蛋白饲料的研究[J].饲料研究，2000（6）：5-7.

[7] 郭壮，白梅，张和平，等.利用甜菜糖蜜生产单细胞蛋白的研究[J].粮食与饲料工业，2008（9）：36-38.

[8] 明红梅，熊俐，曹新志.甘薯淀粉液态发酵生产单细胞蛋白的工艺优化[J].食品与发酵科技，2010，46（3）：68-71.

[9] 邓桂兰.混合菌发酵油茶粕生产菌体蛋白饲料的研究[J].粮食与饲料工业，2008（6）：30-32.

[10] 邓桂兰.油茶饼粕制备SCP菌种筛选发酵工艺条件研究[J].广西轻工业，2008（5）：6-7.

[11] 邓桂兰.油茶饼粕发酵条件的研究[J].现代食品科技，2008（4）：363-365.

[12] 衛洋洋，蔡海莹，张放，等.发酵油茶饼粕饲喂荷斯坦牛的试验研究[J].中国奶牛，2014（1）：8-11.

[13] 卫洋洋.油茶籽粕生物改良及其在奶牛饲养上的应用[D].合肥：安徽农业大学，2013.

[14] 卫洋洋，蔡海莹，王力生，等.单菌固态发酵油茶饼粕生产多酶生物饲料[J].安徽农业大学学报，2012（1）：41-46.