日本血吸虫高迁移率族蛋白活化鼠巨噬细胞的初步研究

李丹丹，马丽贞，苑纯秀，史晓娜，艾 敏，塔 娜，冯新港

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重开放点实验室，上海200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）

·研究论文·

日本血吸虫高迁移率族蛋白活化鼠巨噬细胞的初步研究

李丹丹1,2，马丽贞1，苑纯秀1，史晓娜1,2，艾 敏1，塔 娜1，冯新港1

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重开放点实验室，上海200241；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234）

为研究日本血吸虫高迁移率族蛋白（Schistosoma japonicum high mobility group box1, Sj HMGB1）体外活化小鼠巨噬细胞的功能，利用真核重组Sj HMGB1蛋白与巨噬细胞共培养48 h，流式细胞术检测巨噬细胞表面标志分子以及趋化因子受体的表达。收集Sj HMGB1蛋白与巨噬细胞共孵育48 h后上清，ELISA检测上清中TNF-α与 IL-10的含量，Griess法检测上清中NO的含量。流式结果显示，与对照组相比，Sj HMGB1蛋白刺激组的巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子，TLR4受体以及趋化因子受体CCR7的表达显著上调且差异具有极显著统计学意义（P＜0.01），TLR2受体的表达显著下调，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）。ELISA结果显示，Sj HMGB1能够刺激巨噬细胞分泌致炎因子TNF-α，未能促进抑炎因子IL-10的释放。Griess法表明Sj HMGB1能够促进巨噬细胞分泌NO。本研究结果表明Sj HMGB1可能通过TLR4通路活化小鼠巨噬细胞并诱导其向致炎性M1型巨噬细胞极化。

日本血吸虫；高迁移率族蛋白；巨噬细胞；TLR；细胞因子

血吸虫病是一种人畜共患的慢性消耗性寄生虫病[1]。随着吸血虫耐药性等问题的出现，研制出高效、实用的抗血吸虫疫苗迫在眉睫。研究表明，辐照血吸虫疫苗能够诱导高保护性免疫效果，其机制可能是通过辐照血吸虫来源的分子刺激宿主免疫细胞在肺部形成了以Th1为主要应答的致炎性环境而实现[2]，近年来，探索辐照致弱血吸虫尾蚴或童虫疫苗（RAV）的高保护性效应机制，已成为学者们关注的热点课题，其中RAV的免疫原性分子与细胞基础及机制等问题尤其受到重视[3]。通过研究RAV免疫诱导的高保护性效应机制，推测在辐照致弱血吸虫疫苗模型中可能存在一类虫源性应急分子，如日本血吸虫高迁移率族蛋白（SjHMGB1)、热休克蛋白70（SjHSP70）以及钙网织蛋白（SjCRT)等发挥着重要作用。这些研究结果为研制安全有效的血吸虫分子疫苗提供了指导。HMGB1作为内源性的DAMPs的典型代表，是介导先天性免疫的一个关键分子，在组织损伤、炎症反应、干细胞的募集和活化以及组织修复过程中均发挥作用[4]。王利利等[5,6]研究表明电离辐射可以诱导HMGB1分子通过乙酰化作用从核内至胞浆再到胞外的移位。Gnanasekar等[7]发现，SmHMGB1可以诱导小鼠巨噬细胞产生TNF-α、IL-6、IL-13等细胞因子，故SmHMGB1在曼氏血吸虫中可能是血吸虫宿主体内炎症免疫反应过程中的一个关键分子。据此，我们推测SjHMGB1作为一类虫源性的应急分子，在RAV模型诱导的高保护性免疫效应中，通过与宿主免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞等的相互作用，形成了驱动固有免疫和适应性免疫应答的环境，从而发挥免疫保护作用。相关的研究还显示，巨噬细胞在介导杀灭肺期童虫和形成肺部炎性反应环境中发挥了重要作用。胞外HMGB1可能与细胞表面的相关受体，例如晚期糖基化受体，TLR2、TLR4以及其他未知受体结合从而激活相应的免疫细胞[9,10]。因此，本研究以小鼠RAW264.7巨噬细胞系作为模型，在SjHMGB1刺激后，检测巨噬细胞细胞因子以及细胞表面标志分子与受体的分泌表达情况，为进一步阐明SjHMGB1在 RAV中所发挥的功能提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 DMEM培养基与胰酶购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Gibco公司；PE标记的抗TLR4单抗和FITC标记的抗TLR2单抗购自eBioscience公司；FITC标记的抗MHC-Ⅱ单抗购自BD公司；PE标记的抗CCR7单抗购自BD公司；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go Kit以及Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go Kit购自eBioscience公司；NO检测试剂盒购自普利莱基因技术有限公司；其他试剂为进口或国产分析纯。

1.1.2 蛋白和细胞株 SjHMGB1蛋白为杆状病毒昆虫细胞表达系统所表达，由中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室构建保存；小鼠RAW264.7巨噬细胞株为中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 巨噬细胞的培养 RAW264.7巨噬细胞复苏后，用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基，于37℃、5%CO2的细胞培养箱中定期传代培养，采用处于对数生长期的细胞。

1.2.2 SjHMGB1蛋白刺激巨噬细胞 通过胰酶消化巨噬细胞，收集离心，用完全培养基重悬，调整巨噬细胞的浓度为1×106个/mL，加入48孔细胞培养板中（1 mL/孔）。实验组加入真核蛋白SjHMGB1，浓度为 50μg/mL，同时设阴性对照组（未刺激）和LPS（50μg/mL）阳性对照组。37℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.2.3 流式细胞术检测巨噬细胞表面分子及受体的表达 继续培养巨噬细胞48 h后，收集各组细胞。4℃、239×g离心5 min，细胞沉淀用200 μL RPMI1640悬起，每管加入2μL Rat Anti-Mouse CD16/CD32 抗体，4℃封闭30 min，以消除抗体非特异性结合。用含3%热灭活的胎牛血清及0.1%叠氮钠的PBS缓冲液洗2次，分别加入PE标记的Rat Anti-Mouse TLR4抗体、FITC标记的Rat Anti-Mouse TLR2抗体、FITC标记的Rat Anti-Mouse MHC-Ⅱ抗体、PE标记的Rat Anti-Mouse CCR7抗体，4℃避光孵育30 min，4℃、239×g离心5 min，用预冷的PBS洗2遍，加入400 μL PBS重悬转至流式管中，流式仪检测。

1.2.4 ELISA检测SjHMGB1刺激巨噬细胞后TNF-α和IL-10的分泌情况 采用上述方法处理巨噬细胞并收集培养细胞的上清，按细胞因子待检试剂盒说明书要求稀释各溶液。将稀释后的capture antibody加入96孔酶标板中（100 μL/孔），4℃包被过夜；0.05%PBST洗3遍，用200 μL assay diluent室温封闭1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL 样品或标准品，室温孵育2 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100μL detection antibody，室温孵育1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL酶标二抗，室温避光孵育30 min；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL substrate solution，室温避光孵育15 min；每孔加入50 μL stop solution终止显色，测OD450。

1.2.5 Griess法检测SjHMGB1刺激巨噬细胞后NO的分泌情况 收集上述培养48 h细胞的上清。按照说明书要求取标准品和待测样品加入96孔板中（50 μL/孔），然后每孔加入50 μL Griess R1，室温避光放置5 min；每孔加入50 μL的Griess R2，室温避光放置5 min后，测定OD450，计算得出标准曲线并统计各组NO的浓度。

1.2.6 数据处理 所有的数据均利用t检验进行差异显著性分析，P＜ 0.05为差异具有显著统计学意义，借助Flow Jo，GraphPad Prism 5等软件对所得数据进行分析和制图。

2 结果

2.1 SjHMGB1诱导巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子以及受体分子的表达情况

2.1.1 SjHMGB1诱导巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子上调表达 以流式细胞术检测细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达情况，结果显示，未经处理的巨噬细胞低表达MHC-Ⅱ分子，但SjHMGB1和LPS的刺激能使巨噬细胞诱导性的高表达MHC-Ⅱ分子。与对照组相比，SjHMGB1蛋白能促进巨噬细胞表面高表达MHC-Ⅱ分子且差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。而SjHMGB1刺激组与LPS刺激组相比，巨噬细胞表面MHC-Ⅱ分子的表达差异不具有显著统计学意义（P＞0.05）（图1）。

图1 流式细胞仪分析MHC-Ⅱ分子在巨噬细胞表面的表达Fig.1 FACS analysis of MHC-Ⅱexpression on macrophagocyte注∶ **表示实验组与对照组相比差异具有显著的统计学意义（P＜0.05）Note∶ Statistically signifi cant differences(P＜0.05) between experimental and control group were denoted by**

2.1.2 SjHMGB1诱导巨噬细胞表面TLR4上调表达、TLR2下调表达 检测结果显示，未经处理的巨噬细胞仅少量表达TLR2、TLR4受体，SjHMGB1和LPS的刺激均能使巨噬细胞诱导性的高表达TLR4，低表达TLR2受体，与对照组相比差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）（图2）。

图2 流式细胞仪分析TLR2、TLR4在巨噬细胞表面的表达Fig.2 FACS analysis of TLR2、TLR4 expression on macrophagocyte注∶ **表示实验组与对照组相比差异具有显著的统计学意义; ***表示差异具有极显著的统计学意义Note∶ Statistically signifi cant differences(P＜0.05) between experimental and control group were denoted by**, extremely signifi cant differences(P＜0.01) were denoted by***

2.1.3 SjHMGB1诱导巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7上调表达 由图3的流式结果可知，未经刺激的巨噬细胞能表达一定水平的CCR7，与对照组相比，SjHMGB1和LPS的刺激能上调巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达水平，差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。而SjHMGB1刺激组与LPS刺激组相比，巨噬细胞表面CCR7的表达差异不具备显著统计学意义（P＞0.05)。

2.2 SjHMGB1刺激巨噬细胞分泌细胞因子 ELISA检测巨噬细胞分泌前炎性细胞因子TNF-α含量，由图4可以看出， LPS刺激组和SjHMGB1刺激组中TNF-α的含量显著高于对照组且差异具有极显著统计学意义（P＜0.01），可见，SjHMGB1能促进巨噬细胞分泌前炎性因子TNF-α。

采用ELISA检测巨噬细胞分泌到上清中的IL-10含量，结果见图5。对照组与 LPS刺激组和SjHMGB1刺激组分泌的IL-10的含量差异不具备显著统计学意义（P＞0.05），由此可知，SjHMGB1并没有促进巨噬细胞分泌抑炎因子IL-10。

2.3 SjHMGB1促进巨噬细胞分泌NO Griess检测巨噬细胞分泌到上清中的NO含量，由图6可以看出，与对照组相比，LPS刺激组和SjHMGB1刺激组巨噬细胞分泌NO含量高于对照组，且差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。

图3 流式细胞仪分析CCR7在巨噬细胞表面的表达Fig.3 FACS analysis of CCR7 expression on macrophagocyte注∶ ***表示实验组与对照组相比差异具有极显著的统计学意义Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group were denoted by***

图4 SjHMGB1刺激巨噬细胞产生细胞因子TNF-αFig. 4 Cytokine TNF-α production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1注∶ ***表示实验组与对照组相比差异具有极显著的统计学意义Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group are denoted by***

图5 SjHMGB1刺激巨噬细胞产生细胞因子IL-10Fig. 5 Cytokine IL-10 production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1

图6 SjHMGB1刺激巨噬细胞产生NOFig. 6 NO production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1注∶ ***表示实验组与对照组相比差异具有极显著的统计学意义Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group were denoted by***

3 讨论

研究表明辐照可引起免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），其显著特征是通过释放或表达所谓的危险信号分子如HSP70、HMGB1和CRT等分子来增强免疫应答[11]。刘群等[12]研究发现，SjHMGB1在不同发育阶段血吸虫虫体中均有分布，且在童虫期表达量略高，同时SjHMGB1能够促进宿主DCs的表型成熟。HMGB1可由坏死的细胞被动释放，相关研究结果表明，在辐照尾蚴体外转化的童虫细胞，SjHMGB1能够从核内转移至胞外。我们初步推断在辐照致弱尾蚴/童虫疫苗所诱导的高保护性免疫效应中，SjHMGB1作为一类虫源性应激分子发挥了重要作用。已有研究表明辐照致弱日本血吸虫尾蚴免疫小鼠后，可在宿主肺部和引流淋巴结等部位诱导产生高水平的、以Th1为优势应答的免疫保护效果。活化的免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞和T细胞等通过分泌TNF-α和IFN-γ等细胞因子在致炎性环境的形成中发挥了关键作用。巨噬细胞是单核吞噬细胞系统中具有较强吞噬功能的细胞类型，它的一个重要功能就是通过抗原提呈参与特异性免疫应答的调节，而其表面MHC-Ⅱ分子是介导抗原提呈的一类主要分子[13]。已有研究表明在血吸虫感染的病理进程中，巨噬细胞作为先天性免疫细胞参与其中并发挥了重要的作用。但是，SjHMGB1是否能够在体内活化宿主巨噬细胞，从而形成有利于机体的以Th1为优势应答的免疫保护环境，尚需我们进一步验证。本研究检测SjHMGB1刺激小鼠巨噬细胞后，细胞表面的MHC-Ⅱ分子的表达量显著增高，初步提示SjHMGB1蛋白刺激可使巨噬细胞活化，显示抗原提呈功能。

Toll受体TLR是参与固有免疫的一类重要受体，也是连接固有免疫和适应性免疫应答的桥梁，广泛分布于各类免疫细胞，其中TLR2、TLR4主要表达在巨噬细胞表面，其配体多是病原相关分子模式（PAMPs）。单核巨噬细胞表面的TLR与PAMPs作用后，启动信号传导，为巨噬细胞的成熟提供信号，增强其吞噬杀菌能力，同时释放一系列细胞因子引起炎症反应和参与免疫调节[14,15]。研究发现蛋白刺激巨噬细胞后，细胞表面TLR4上调表达，TLR2下调表达，提示 SjHMGB1蛋白活化巨噬细胞可能是通过TLR4受体介导的途径。

已有研究表明在致炎性的M1型巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7呈现高表达，它能够使免疫细胞被募集到靶器官如肺部或者引流淋巴结等部位，进而产生细胞毒效应，活化其他细胞等作用，对诱导宿主保护性免疫应答至关重要。本研究发现，SjHMGB1蛋白刺激后可使巨噬细胞表面的CCR7上调表达，提示蛋白刺激后，巨噬细胞可能具有致炎性的M1型巨噬细胞的功能。

活化的巨噬细胞能够合成和分泌大量的细胞因子参与免疫调节。有关研究表明TNF-α是诱导炎症反应重要的细胞因子，在炎症发生的早期，作为重要的早期促炎因子，参与了固有免疫和适应性免疫应答。TNF-α能够导致炎性细胞浸润以及增强吞噬细胞的杀伤作用。IL-10是重要的抑炎细胞因子，能诱导初始T细胞向调节性T细胞分化。因此，通过检测巨噬细胞分泌相关细胞因子的情况就可以初步推断巨噬细胞的功能活性。本研究通过ELISA检测蛋白刺激巨噬细胞分泌到胞外的TNF-α和IL-10的含量，发现蛋白刺激能够促进巨噬细胞TNF-α的分泌，而对IL-10的分泌无显著差异，初步提示蛋白刺激可以使巨噬细胞的功能成熟。

活化的巨噬细胞不仅能够分泌细胞因子，还能够分泌NO。有研究显示由巨噬细胞产生的NO在杀灭肺期血吸虫童虫时起重要作用[16]。因此，通过测定蛋白刺激巨噬细胞分泌的NO的含量变化可以反映巨噬细胞的功能活化状态。研究发现SjHMGB1蛋白能够促进巨噬细胞NO的分泌，提示巨噬细胞的炎症反应功能被活化。但是辐照致弱日本血吸虫来源的SjHMGB1分子在宿主体内是否也能够通过巨噬细胞产生的NO来消除肺期的日本血吸虫童虫，仍有待进一步验证。

本研究结果初步表明SjHMGB1能够通过TLR4通路促进巨噬细胞表型及功能成熟，并诱导其向致炎性的M1型巨噬细胞分化，为形成以Th1为优势应答的炎性环境创造了条件。研究结果为进一步阐明SjHMGB1在辐照致弱血吸虫（RAV）诱导宿主产生的高保护性免疫效应中所发挥的作用及机制提供了基础资料。

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PRELIMINARY STUDY ON THE ACTIVATION OF MACROPHAGOCYTES BY HIGH MOBILITY GROUP BOX1 PROTEIN OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

LI Dan-dan1,2, MA Li-zhen1, YUAN Chun-Xiu1, SHI Xiao-na1,2, AI Min1, TA Na1, FENG Xin-gang1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

This study aimed at determining the activation of high mobility group box1 protein (SjHMGB1)of Schistosoma japonicum on mouse macrophagocyte. When Recombinant SjHMGB1 protein from eukaryotic cell expression system was incubated with macrophage for 48 h, the expression of macrophage surface molecules and chemokine receptors were detected by fl ow cytometry. TNF-α and IL-10 in the culture supernatant were detected by ELISA, and the content of NO in supernatant was assayed by Griess method. Results showed that, compared with the control group, the expression levels of MHC-Ⅱmolecules, TLR4 receptor and chemokine receptor CCR7 on the surface of macrophage stimulated by SjHMGB1 group were signifi cantly increased (P ＜ 0.01), while TLR2 receptor was signi fi cantly decreased (P＜0.05). The results of test by ELISA demonstrated that SjHMGB1 could stimulate the secretion of infl ammatory factor TNF-α, and fail to promote the release of IL-10 on macrophage. The result of test using Griess method showed that SjHMGB1 could promote the secretion of NO on macrophage. The data suggest that SjHMGB1 could activate mouse macrophages via TLR4 andinduce macrophages to undergo M1-type infl ammatory polarization.

Schistosoma japonicum; high mobility group box1 protein; macrophagocyte; TLR；cytokine

S852.735

A

1674-6422（2017）01-0059-07

2016-02-02

中国农业科学院动物血吸虫病创新团队基金

李丹丹，女，硕士研究生，动物学专业

冯新港，E-mail:xingangf62@aliyun.com