内皮素受体在人食管下括约肌上的分布及其作用

张珂刘俊峰何士骄樊崇利吴艳刚包永松宋晓辉

·论著·

内皮素受体在人食管下括约肌上的分布及其作用

张珂1刘俊峰2何士骄3樊崇利4吴艳刚4包永松4宋晓辉4

目的通过检测各内皮素受体（ETR）亚型在人食管下括约肌（LES）上，特别是套索纤维和钩状纤维上的分布规律，探讨内皮素对LES收缩和舒张功能的作用。方法在罹患食管中上段癌患者的术后标本上，取LES的套索纤维和钩状纤维，并分别以食管下段和胃底部的环形肌肉作为对照。采用蛋白印迹法（Western Blot）、RT－PCR和半定量PCR（semi－qPCR）分析ETR在人LES上的分布规律。结果ETR的A亚型（ETA）和B亚型（ETB）被确认都存在于LES上。ETR两个受体亚型的蛋白质和m RNA表达水平比较，差异均有统计学意义（F＝533.841，P＜0.01；F＝72.291，P＜0.01）。ETA显著高于ETB表达量（约为5∶1），差异有统计学意义；而同一受体亚型在钩状纤维（C）、套索纤维（S）、食管下端环形肌（E）、胃底环形肌（G）4个位点上的表达量比较差异无统计学意义（F＝0.398，P＝0.5329）。结论ET受体，特别是ETA受体亚型在人LES的舒张、收缩功能调节中发挥着重要作用，是食管运动障碍性疾病治疗的靶向受体。

ET受体； 食管下括约肌； 钩状纤维； 套索纤维； 人

在人体内分布有内皮素受体（endothelin receptor，ETR）的生理系统内，ET通过与两个不同的ETR亚型（ETA和ETB）结合来发挥作用。ETR的两个亚型都是G蛋白偶联受体超家族内的一员，相对分子量为45 000～50 000。其结构在所有哺乳动物体内都是高度保守的，并且生物特性也因为大部分的分子结构相同而相似。特别是保守的2和5跨膜区已经被证实在受体亚型与选择性配体结合和多肽类物质锚定过程中发挥了重要的作用［1－8］。

既往的一些研究［9－11］已经证实ETR各亚型均存在于诸如老鼠、豚鼠和兔子等哺乳动物的整个胃肠道内。然而，却几乎没有关于ETR在人食管下括约肌（lower esophageal sphincter，LES）上的研究。

食管运动性疾病，例如胃食管反流性疾病和贲门失弛缓症，都被认为是LES出现了功能紊乱造成的。目前除了外科手术，对这类疾病的有效内科治疗还未问世。以往的研究［12－13］表明内皮素能够引起食管黏膜肌层的收缩，因此，ETR的激动剂和拮抗剂可能成为治疗食管运动性疾病的潜在药物。

材料和方法

一、临床资料

本实验所用肌条取自于2011年11月至2012年12月在河北省肿瘤医院就诊的32例中段食管癌患者，其中男性24例，女性8例；年龄51～70岁，平均年龄61岁。剔除有胃食管反流性疾病或其他食管动力障碍性疾病史的病例。每一份标本在手术室内整块切除后，均立即放置于低温Krebs溶液［14］内保存，标本如含有肉眼可见的癌组织也被排除。本实验的知情同意书已获河北医科大学第四医院伦理委员会批准。

二、标本获取

在实验室内，新鲜的食管胃结合部标本被立即放置于4℃的TBS液内，以37℃Krebs溶液冲洗固定于蜡盘上并浸泡在TBS液内，并以5%CO2混合95%O2保证标本活性；然后以锐性分离的方法轻柔地将黏膜层和黏膜下层组织去除；最后分别自套索纤维、食管下端环形肌、钩状纤维和胃底环形肌制备肌条。

LES是位于食管胃结合部的一条环形增厚的肌肉。套索纤维和钩状纤维被认为分别是临近胃大弯和胃小弯的贲门处环形增厚的平滑肌组织［15－16］；同时准备了食管下端和胃底部的环形肌条作为对照。所有环形肌条必须防止全层自标本上分离出，以避免标本内含有肌间神经丛和纵行肌束。解剖下来的肌条立即冻于液氮内，放置于－80℃冰箱内保存（图1）。

图1 食管胃结合部标本沿胃大弯切开后固定于蜡盘上，锐性分离掉掉黏膜和黏膜下组织

三、实验方法

1.总RNA提取和反转录：各位点的肌条组织均以100 mg∶1 ml的组织、试剂比在TRIzol（美国Invitrogen公司）试剂中匀浆化后，再以12 000×g离心5 min；提取出总RNA后进行反转录合成cDNA。

2.RT－PCR的反应条件：引物如表1所示。各ETR亚型的反应条件都相同（包括内参）：95℃初始变性5 min，43个循环扩增（95℃30 s，58℃30 s，72℃延伸45 s）；72℃10 min终止反应。空白对照采用不含引物的cDNA样品扩增。反应产物取6～8μl在1.5%～2%琼脂糖凝胶电泳。然后用Gel－Pro凝胶成像分析系统分析记录，通过ETR各亚型扩增产物所测量出的灰度值与β－actin内参的比值表示其相对表达量。

表1 RT－PCR引物

3.实时定量PCR反应条件：引物如表2所示。各ETR亚型的每个反应条件都相同（包括内参）（美国Life公司ABI 7500）：初始变性温度95℃，10 min，扩增43个循环（变性95℃15 s，56℃退火15 s，延伸温度72℃30 s），最后熔解曲线验证。m RNA相对表达量E目标＝2－（Ct目标－Ctβ－actin）［17］由ABI 7500机器自带软件处理。

表2 实时定量PCR引物

4.蛋白印迹法（Western Blot）：电泳分离蛋白质后转膜、抗体封闭及洗膜。最后，应用LI－COR公司的奥德赛红外影像仪处理显色、扫描PVDF膜并摄像。再以奥德赛3.0软件统计相对表达量（IOD值），做半定量分析。

四、统计学处理

以SPSS 19.0软件进行统计学分析。EAT和ETB的mRNA和蛋白相对表述量以±s表示，组间比较以单因素方差分析（ANOVA）处理，SNK－q检验进行两两比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、ETA m RNA和ETB m RNA的表达

1.RT－PCR检测：ETR的两种受体mRNA均被检测到表达于人LES上，且两种受体亚型的表达量有显著差异，ETA的表达要强于ETB（图2），同一受体亚型在检测的4个肌条之间并无统计学差异（图3）。

图2 同一肌条上，ETA和ETB的表达量有显著差异，且4个检测位点情况类似。N：空白对照；β－actin：内参

图3 检测的4个肌条上，同一受体的表达量无显著差异。C：钩状纤维（clasp）；S：套索纤维（sling）；E：食管下端环形肌（esophagus）；G：胃底环形肌（gastric fundus）

2.半定量PCR（semi－qPCR）检测：ETR两种受体亚型的检测结果显示，在同一肌条上的扩增曲线分离（图4），其表达量有显著差异（F＝72.291，P＜0.01）；而同一亚型m RNA在4个位点间比较，差异无统计学意义（F＝0.398，P＝0.533）（图5）。

图4 qPCR各扩增曲线分离

图5 qPCR检测显示，同一肌条上2个受体亚型表达量有显著差异（F＝72.291，P＝0.000）；同一受体亚型在检测的各位点间无统计学差异（F＝0.398，P＝0.533）。C：钩状纤维（clasp）；S：套索纤维（sling）；E：食管下端环形肌（esophagus）；G：胃底环形肌（gastric fundus）

二、ETA和ETB蛋白的表达

Western Blot检测显示：各受体亚型蛋白均被检测出。且根据IOD值比较发现：在同一肌条上，两种亚型受体表达量比较，差异有统计学意义（F＝533.841，P＜0.01）；同一受体亚型在4种不同肌条上的表达量比较，差异无统计学意义（F＝0.398，P＝0.755）（图6）。

图6 Western Blot检测结果。在同一肌条上，两种亚型受体表达量有显著差异（F＝533.841，P＜0.01）；同一受体亚型在4种不同肌条上的表达量无统计学差异（F＝0.398，P＝0.755）。C：钩状纤维（clasp）；S：套索纤维（sling）；E：食管下端环形肌（esophagus）；G：胃底环形肌（Gastric fundus）

讨 论

ETR属于有7个跨膜结构的G蛋白偶联受体超家族，哺乳动物机体内分布有各个亚型。因此，ETR的激活或失活能够调节多种生理和病理过程。

人食管动力学疾病，例如弥漫性食管痉挛、贲门失弛缓症、胃食管反流病、胡桃夹食管和其他疾病，均与人LES复合体的运动功能失调密切相关。已有研究［16］证实：LES的调节包含多种受体、神经递质和信号转导通路。CCK受体、M受体已经被证实在LES的调节过程中起重要作用。本研究的目的是通过检测ETR各亚型受体蛋白质和mRNA在人LES，特别是套索纤维和钩状纤维组成的人LES复合体上的分布情况，为进一步探索内皮素在人LES的收缩和舒张过程中所发挥的作用打下基础。

本研究发现，ETA和ETB的相应m RNA及受体蛋白在人LES的套索纤维和钩状纤维中均有分布，结果与大部分学者研究结论一致。既往在哺乳动物的研究中发现，ETR广泛分布于平滑肌组织中，并且与胃肠道的动力调节和腺体分泌密切相关，并且内皮素在肠道内的药理学作用也已经被发现。Kitsukawa等［18］发现胃平滑肌分布有两种ETR亚型，但只有一种亚型可以引起收缩张力变化。Huang［19］发现内皮素与ETA和ETB结合后，能够分别引起豚鼠LES的舒张和收缩，并且他认为内皮素可能在LES的运动控制中起主要作用，因此他建议应进一步研究并评估内皮素相关配体在胃食管反流病中对人LES所起的作用。

ETR的第三种受体亚型，即ETC，在部分物种体内也被发现，但人体内并没有发现ETR的表达［20］。因此，本实验仅检测了ETA和ETB两种受体亚型。

本研究还发现，ETA的受体蛋白和mRNA表达量最高；ETA∶ETB约为5∶1，同一亚型在不同位点间无差异。这是第一次采用半定量方法在人LES上证实了ETR分布，并且发现了统计学差异。同时，第一次发现这两种受体亚型也分布于胃底和食管体的横行平滑肌上，但是本研究结果与Huang等［21］的研究结果不同。Huang等［21］通过药理学方法发现ETA和ETB的mRNA分布于食管平滑肌上，且ETA和ETB的表达水平基本相同。我们分析发现：两项实验结果的差异很大程度上是由于选择了不同的实验方法所造成的。本研究采用的实时定量PCR和Western Blot被认为比既往采用药理学方法测定受体定量更为精确。而Huang等［21］使用的药理学方法中，缺乏对ETR各亚型有绝对特异性结合力的配体，因此得出的结论必然存在相互干扰的误差。另一个重要原因是，Huang等的检测标本与本研究不同，其所研究的是黏膜肌层的肌条，而本研究采用的是食管肌层的肌条。另外，Huang等在实验中通过测定Bmax判断表达量［21］，且激动剂为非选择性与受体结合，这种药理学方法检测的灵敏度低于分子生物学方法。

在目前的研究结论基础上，进一步对ETA和ETB在食管动力学病理和生理方面的研究可能为治疗此类疾病提供有效方法。ETR的高选择性激动剂和拮抗剂可能成为治疗此类疾病的有效药物，这类药物的成功研制将可能取代目前存在很高并发症的手术治疗。

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Distribution and role of endothelin receptors in human lower esophageal sphincter

ZhangKe1，Liu Junfeng2，HeShijiao3，FanChongli4，WuYangang4，BaoYongsong4，SongXiaohui4.1DepartmentofThoracicSurgery，AffiliatedHospitalofHebeiUniversity，Baoding071000，China；2DepartmentofThoracicSurgery，TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050019，China；3DepartmentofOncology，4DepartmentofOrthopaedics，ThePeople’sHospitalofQingyuanDistrictofBaodingCity，Baoding071100，China

：LiuJunfeng，Email：tumor＠vip.qq.com

ObjectiveTo detect the distribution of endothelin receptors（ETR）in the human lower esophageal sphincter（LES），especially on the clasp and sling smooth muscle fibers of the LES，and investigate the effects of endothelins on the contraction and diastole of LES.MethodsThe sling and clasp tissues from LES were obtained from esophageal carcinoma patients，and the circular muscle tissues from the esophagus and gastric fundus were served as controls.Western Blot，RT－PCR and semi－qPCR were employed to determine the distribution of ETR in human LES.ResultsEndothelin receptor type A（ETA）and endothelin receptor type B（ETB）were found in human LES.There were significant differences in the expression of protein and m RNA between two isoforms of ETR（F＝533.841，P＜0.01；F＝72.291，P＜0.01）.The expression level of ETA was significantly higher than that of ETB（about 5：1）.For distribution of each isoform，there was no significant difference in the expression level among four sites of clasp fibers（C），sling fibers（S），lower esophageal sphincter（E）and gastric fundus circular muscle（G）（F＝0.398，P＝0.5329）.ConclusionsETRs contribute to the adjustment of contraction and diastole of human LES，especially the ETA.ETRs are the potent therapeutic targets for esophageal mobility diseases.

ET receptor； Lower esophageal sphincter； Clasp fiber； Sling fiber； Human

2016－11－05）

（本文编辑：周珠凤）

10.3877/cma.j.issn.2095－8773.2017.01.01

国家自然科学基金（30371413）

071000 保定，河北大学附属医院胸外科1；050019 石家庄，河北医科大学第四医院胸外科2；071100 保定市清苑区人民医院肿瘤科3，骨科4

刘俊峰，Email：tumor＠vip.qq.com

张珂，刘俊峰，何士骄，等.内皮素受体在人食管下括约肌上的分布及其作用［J/CD］.中华胸部外科电子杂志，2017，4（1）：1－6.