杜鹃分子标记的研究进展

罗清+梁春+唐莹莹+秦玉燕+卢业飞+覃坤兰

摘 要：文章对近年来杜鹃分子标记的研究工作进行了梳理和总结，综述了ISSR、AFLP、RAPD、SSR及SRAP等分子标记在杜鹃的应用，并展望应用前景和提出了建设性意见，为日后开展杜鹃品种鉴定及遗传多样性分析、分子标记辅助育种、构建统一的分类系统及分子标记研究等提供参考依据。

关键词：杜鹃 分子标记 进展

杜鹃花（Rhododendron simsii Planch.）是杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃属（Rhododendron L.）常绿或落叶多年生植物，全世界约有960余种。我国杜鹃花自然分布广泛，占世界种类的59 %，因其种类繁多、花色艳丽、株型多样闻名于世。我国丰富的杜鹃花资源传布到世界各国并经植物学家及园艺学家繁殖培育，获得了大量的杂交組合及新品种，至今栽培出的园艺品种近万种。由于杜鹃花品种繁多、产区广泛、新品种审定不及时、地区使用习惯称呼不同等，出现了许多同名异种及同种异名的现象，此外我国广阔土地的深山野林中还有许多未被保存的杜鹃种质资源。因此，对杜鹃种质资源进行有效分类与鉴定是今后深入开展杜鹃育种研究的基础。

近年来随着分子生物学的迅猛发展，分子标记技术广泛应用于杜鹃研究。分子标记是揭示碱基序列变异的遗传标记，与细胞学标记、形态学标记、生物化学标记相比，不受环境、发育阶段等影响，且检测手段迅速简单、多态性高、稳定准确，是形态学分类的重要补充。文章综述了近年来分子标记技术在杜鹃研究中的应用，以期为日后杜鹃花系统分类、合理开发利用杜鹃种质资源提供参考。

1 分子标记的发展动态

分子标记是植物DNA水平上遗传多样性的体现，新型分子标记技术的大量涌现大大缩短了植物常规育种的周期，分子标记已广泛应用于植物遗传结构检测、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性分析及转基因研究等方面[1-2]。目前分子标记种类繁多，根据不同的核心技术可分为3类： 第一类以Southern杂交为核心，如RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）；第二类以PCR反应为核心，包括多位点标记方法RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、DAF（DNA Amplification Fingerprinting）、SSCP（Single Strand Conformational Polymorphism）、SSR（Simple Sequence Repeats）、小卫星DNA（Minisatellite DNA）等，位点特异的PCR标记方法ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）、AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）、STS（Sequence Tagged Site）等及PCR与酶切相结合的方法AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）等；第三类以单核苷酸多态性或mRNA为核心，主要以SNP（Single Nucleotide Polymorphic）技术和EST（Expressed Sequence Tag）技术等为代表[3-7]。

分子标记技术能够更深层次的解释生命现象本质，使我们认知范围从宏观表型到微观世界[8]。分子标记直接反映DNA水平上的遗传多样性，能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段[9]。因此，在形态分类学基础上结合分子标记技术进行物种鉴定与分类对物种的种质资源研究及品质创新具有重要的意义。

2 主要分子标记的研究

2.1 杜鹃ISSR分子标记的应用

ISSR （简单重复序列间多态性）分子标记技术由Zietkiewicz等[10]提出，在SSR基础上发展起来的分子标记，属于位点特异的PCR标记。ISSR标记具有实验成本低廉、实验操作简单、引物适用广泛等优点[11-12]。

目前国内学者在杜鹃属植物种群间的遗传多样性和种间亲缘关系分析研究中运用最多的分子标记是ISSR标记。刘旭颖等[13]将ISSR用于9种杜鹃花的亲缘关系分析，扩增出522条带，其中有90.63 %是多态性的。遗传距离从0. 1833到0. 7236，表明种间具有较丰富的遗传多样性。郑宇等[14]研究了11个杜鹃栽培品种的遗传多样性，Shannon多样性指数为0.4742，表明遗传多样性水平较高。彭婵等[15]、赵芯等[16]及罗清等[17]学者都利用ISSR分子标记技术分别对不同的野生杜鹃属植物种群进行遗传关系研究，结果都表明种群遗传多样性处于较高水平，种群间的基因交流频率很高，能较好的适应当前环境。孔刚[18]对福建旗山2个马银花（R. ovatum （Lindl.） Planch. ex Maxim. ）种群研究，2个种群的基因流 Nm=0.2627<1，表明种群基因交流较少，可能由于种群所处的生境与外界联系甚少，被周围环境的高山与溪流所阻隔。钟容等[19]对筛选出13条引物进行PCR扩增，研究表明4种杜鹃花遗传背景既有相同之处又有一定差异。陈春福[20]以九仙山上的鹿角杜鹃（R. latoucheae Franch.）与满山红（R.mariesii Hemsl.et Wils.） 6大类为实验材料， ISSR分子标记分析表明，在不同海拔处的株系呈现出较大的遗传差异，可能与植株所处的环境条件、气候等因素有关。赵冰等[21]对秦岭地区美容杜鹃（R. calophytum Franch.）的5个野生种群通过ISSR分子标记技术分析其遗传多样性，表明不同种群间的美容杜鹃遗传多样性水平差异大，遗传分化的程度与地理距离无相关性。而赵凯等[22]学者研究群居的都支杜鹃（R. shanii Fang）遗传多样性较低，但是遗传距离却与地理距离显著相关，可能是都支杜鹃高度一致性的生境及异交的生活特性所导致。王刚[23]对黄山杜鹃（R. maculiferum Franch.）5个种群利用ISSR标记进行研究，种群间遗传水平不高，需对幼苗进行混合繁殖，加大居群间迁移和交流使居群间的遗传基因重组，以此提高黄山杜鹃种群的遗传多样性水平。

2.2 杜鹃AFLP分子标记的应用

AFLP（扩增片段长度多态性）由荷兰科学家Pieter Vos等[24]提出，是3端具有选择性的双引物PCR标记，属于PCR与酶切相结合的方法[25]。AFLP分子标记具有重复性好、多态性强、分辨率高及样品适用性广等优点，在构建遗传图谱、遗传育种、基因表达与调控、物种分类和进化等方面有着广泛的应用前景。

AFLP标记一次单个反应可检测到大量限制性片段， AFLP是最有效的分子标记，由于实验结果数据统计量庞大，因此运用在杜鹃属植物上较少，仅有几个学者采用AFLP标记对杜鹃遗传多样性进行分析。纵丹等[26]采用AFLP标记对马缨杜鹃（R. delavayi Franch.）5个居群进行检测与分析，居群內83.12 %发生遗传变异，基因流为2.4624，居群遗传多样性较高。赵冰等[27]研究秀雅杜鹃（R. concinnum Hemsl.）种群的遗传分化程度及遗传多样性，结果表明秀雅杜鹃无论在种群水平还是物种水平上遗传多样性都比较高，遗传变异主要在种群内部，且遗传距离与地理距离相关性不显著。吴富勤[28]对2个居群的大树杜鹃（R. protistum Balf. f. et Forrest var. giganteum （Tagg） Chamb. ex Cullen et Chamb.）利用AFLP分子标记来研究遗传结构与遗传多样性，研究显示2个居群间的遗传分化程度低，基因流较高，遗传多样性在物种水平上较高。其研究结果印证了“狭域分布的小种群亦能维持较高的遗传多样性”的假说。

2.3 杜鹃RAPD分子标记的应用

RAPD（随机扩增多态性DNA标记）是由Williams等[29]提出，是基于PCR技术对未知序列的基因组检测DNA多态性的方法。RAPD分子标记具有操作简单易行、易于程序化、所需DNA样品量少、退火温度低、实验周期短等优点，因此被广泛应用于遗传学、系统发育学与分子生药学等领域。

张春影等[30]对不同海拔牛皮杜鹃（R. aureum Georgi）种群利用RAPD标记进行遗传多样性分析：产地不同的种群遗传多样性高，可能与气候因子、环境因子及地理因子等因素综合影响有关；产地相同的遗传多样性水平低，可能是由于分生境狭小产生地理间隔的生殖屏障，阻断基因交流。姬文秀等[31]利用RAPD标记鉴定出6份大字杜鹃（R. schlippebachii Maxim.）的亲缘关系。刘雁飞[32]对长白山居群牛皮杜鹃进行研究，借助RAPD分子标记分析，发现遗传多样性与遗传结构受地理环境的影响，遗传多样性水平高，说明牛皮杜鹃适应环境的能力较强。

2.4 杜鹃SSR分子标记的应用

SSR（简单序列重复）由Moore[33]提出，是重复单位（含有1～6个核苷酸）组成的基序串联重复而成的DNA序列，为单引物PCR标记。SSR长度的高度变异性是SSR标记产生的基础。SSR分子标记具有等位基因变异多、多态性高、信息量丰富、重复性好、结果可靠及呈共显性等优点，具有巨大的应用价值，因而该技术被用于目标基因的标定、分子辅助选择育种、遗传机制、品种测定和遗传连锁图谱构建等的研究中。

虽然目前最接近理想的分子标记是SSR标记，但引物开发要建立在已知的DNA序列上，由于杜鹃植物DNA序列信息相对缺乏的情况下，使得杜鹃SSR标记引物的开发相对较少，因此国内学者在杜鹃属植物上对SSR标记的应用不多[34-36]。周泓[37]运用Dendauw等开发的SSR引物对130个杜鹃花进行SSR分子标记实验，所用引物呈现的多态性都比较高，聚类结果与传统分类系统基本吻合。吴富勤[28]运用SSR标记对居群大树杜鹃进行保护遗传学研究，结果表明大树杜鹃历史基因流高，经过多年演变现已不能维持足够的等位基因丰富度，近代基因流低，濒临极危的状态，建议加强基因交流，就地保护与迁地保护相结合，扩大有效居群地。

2.5 杜鹃SRAP分子标记的应用

目前在杜鹃属上应用的还有SRAP分子标记。该分子标记由于2001年美国加州大学Li和Quiros[38]博士提出的，是基于PCR的一种新型的标记系统。SRAP分子标记具有高共显性、重复性好、方便测序和简单高效等优点，应用于重要性状基因标记、比较基因组学、遗传多样性分析及遗传图谱构建等研究领域。

苏家乐等[39]运用SRAP分子标记鉴别了10份杜鹃属植物，遗传分化明显，遗传多样性高，分类结果与传统形态学基本一致。吴月燕等[40]以24个西洋杜鹃为实验材料，优化建立了适合西洋杜鹃的SRAP-PCR反应体系，并利用该体系对供试材料进行了遗传多样性分析，结果显示SRAP分子标记可以很好用于该实验材料的鉴定。

3 总结与展望

分子标记技术已广泛应用于杜鹃遗传育种中，在遗传多样性分析、亲缘关系研究与种质资源鉴定等方面开展了一系列工作并获得了一些成果。多态性信息的统计分析可以从分子水平提供杜鹃遗传变异的证据，为全面掌握现有杜鹃资源的遗传多样性提供参考。从基因组DNA水平上的差异研究杜鹃亲缘关系，结果客观准确，为选育杂交优势强、性状优良的杜鹃品种提供理论支撑。杜鹃品种繁多、市场混乱，分子标记技术以品种间变异的可识别性与稳定性成为传统植物鉴别方法的有效补充。

杜鹃分子水平研究仍处于起步阶段，遗传图谱构建与辅助选择育种等研究未见报道。遗传图谱是遗传育种及分子克隆的理论基础，高密度遗传图谱的构建可有效开展质量、数量性状定位、分子标记辅助育种及比较基因组学等研究。分子标记辅助育种可对目标性状进行早期选择，从而缩短育种周期。

在与常规育种技术相结合的基础上，开展杜鹃分子水平研究，开发更为高效的分子标记技术，各种分子标记技术相互渗透，使用构建杜鹃遗传连锁图谱，利用与目标性状连锁的分子标记进行辅助选择育种成为今后杜鹃分子标记育种的研究重点，可为杜鹃名品鉴赏、杂交亲本选择、传统分类学等提供丰富的分子水平依据。

参考文献

[1] Marian C O， Krebs S L， Arora R. Dehydrin variability among Rhododendron specie： a 25-kDa dehydrin is conserved and associated with cold acclimation across diverse species[J]. New Phytologist， 2004， 161（3）： 773-780.

[2] Pavingerova D， Briza J， Kodytek K， et a1. Transformation of Rhododendron spp.Using Agrobacterium tumefaciens with a GUS—intron chimeric gene[J]. Plant Science， 1997， 122： 165-171.

[3] Rick J， Dendauw J， Mertens M， et al. Validation of criteria for the selection AFLP markers to assess the genetic variation of abreeders collection of evergreen azaleas[J]. Theor Appl Genet， 1999， 99（78）： 1155.

[4] ZietkiewiC Z E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymer asechain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20（2）： 176-183.

[5] 王艳，韩英鹏，李文滨，等. 大豆分子标记研究新进展[J]. 大豆科学， 2015， 34（1）： 148- 154.

[6] 罗兵，孙海燕，徐港明，等.SSR分子标记研究进展[J]. 安徽农业科学，2013，41（12）：5210- 5212，5246.

[7] Li J M， Jin Z X. Genetic structure of endangered Emmenopterys henryiOliv based on ISSR polymorphism and implication for its conservation[J]. Genetica， 2008， 133：227.

[8] 周宇爝. 分子标记发展简史[J]. 现代农业科技，2009（11）：264-270.

[9] 朱岩芳，何洪兵，于莉莉. 分子标记技术在植物种质鉴定中的鉴别效率比较[J]. 安徽农业科学，2015，43（10）：38-39.

[10] Zietkiewicz E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20（2）： 176-183.

[11] Bornet B， Goraguer F， Joly G， et a1. Genetic diversity in European and Argentinian cultivated potatoes（Solanum tuberosum subsp. tuberosum）detected by inter—simple sequence repeats （ISSRs）[J]. Genome， 2002， 45： 481-484.

[12] 李 琳，魏灵珠，程建徽，等.24份葡萄种质亲缘关系的ISSR分析[J]. 浙江农业学报，2013，25（4）：772-776 .

[13] 刘旭颖，沈向群，张艳红. 9种耐寒杜鹃花亲缘关系ISSR分析[J]. 西北农业学报，2010，19（7）： 89-92.

[14] 郑宇，何天友，陈凌艳，等. 比利时杜鹃栽培品种（系）的ISSR分析[J]. 福建农林大学学报（自然科学版），2011，40（3）：271-275.

[15] 彭婵，张新叶，杨彦伶，等. 湖北麻城杜鹃古群落遗传多样性研究[J]. 湖北林业科技， 2010（4）：26-30.

[16] 赵芯，金则新，李建輝，等. 麂角杜鹃遗传多样性的ISSR分析[J]. 江苏农业科学，2010（3）：34-36.

[17] 罗清，卢业飞，於艳萍，等. 24份杜鹃属植物的ISSR分子鉴定[J]. 西北林学院学报，2016，31（3）：1-5.

[18] 孔刚. 福建杜鹃花遗传多样性ISSR分析及其离体保存[D]. 福建：福建农林大学，2011.

[19] 钟容，丁显平，李创，等. 金佛山特有杜鹃花遗传多样性分析[J]. 四川大学学报（自然科学版），2015，52（2）：388-392.

[20] 陈春福. 福建杜鹃花属若干种类的离体繁殖与保存及其ISSR分析[D]. 福建：福建农林大学，2012.

[21] 赵冰，郑茜子，李厚华. 秦岭山区美容杜鹃五个野生种群遗传多样性的ISSR分析[J]. 广西植物，2015，35 （5）：761-767.

[22] 赵凯，王德元，张文娟，等. 都支杜鹃遗传多样性的ISSR分析[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（5）：578 -584.