天冬多糖对低氧条件下人肝癌细胞生长、侵袭及迁移的影响

丁婕妤，王璇，翁苓苓，李琦，张闽光，邢东炜

(1上海中医药大学附属市中医医院，上海200071；2上海中医药大学附属曙光医院)

原发性肝癌(以下简称肝癌)是一种发病率高，发生、发展复杂的恶性肿瘤，病死率仅次于肺癌和胃癌[1,2]。我国的肝癌患者大多数由肝炎、肝硬化演变而来，肝纤维化使得肝脏整体缺乏供血，加之肝癌细胞的快速增殖特性，造成了肝癌组织的局部低氧微环境生物学特征。近年研究发现，低氧微环境与肿瘤的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关，是导致肿瘤治疗失败和预后不良的原因之一。肝癌在低氧条件下可出现适应性反应，诱导许多适应性反应因子的生成，促进血管新生、肿瘤生长。因此，探讨低氧条件下治疗肝癌的方法，对于肝癌的临床治疗及预后具有重要意义。天冬是我国传统的中草药，《中医药典》认为天冬甘、苦、寒，主治咽干口渴、肠燥便秘等。天冬多糖是天冬提取物中的主要成分之一，具有提高免疫力、改善肝功能等作用[3,4]。研究发现，天冬多糖在体外可抑制肝癌细胞生长，在体内可延长荷瘤动物的存活期[5～8]。但天冬多糖对低氧条件下肝癌的抑制作用及机制尚不明确。2015年6月～2016年2月，我们观察了天冬多糖对低氧条件下人肝癌细胞生长及侵袭迁移能力的影响，为进一步研究天冬多糖的抗肿瘤作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人肝癌细胞系 HepG2细胞(上海中科院细胞所)。天冬多糖(西安斯诺特公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；双抗(青霉素-链霉素)(美国Gibco公司)；胰酶(美国Sigma公司)；CCK-8试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)；Transwell 小室(美国康宁公司)。

1.2 细胞培养 HepG2细胞复苏后于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，将细胞浓度调整为5×104～8×104/mL，然后用移液器以100 μL/孔接种于96孔培养板中，加入等体积PBS。待细胞贴壁，弃去培养基。

1.3 天冬多糖对低氧条件下HepG2细胞的生长抑制作用观察 采用CCK-8法。细胞培养后，在96孔培养板中，分别加入天冬多糖500、1 000、1 500、2 000、3 000、4 000 μg/mL，另设空白对照孔加入生理盐水。每个剂量设6个复孔，放入低氧培养箱(95%N2，5%CO2，1%O2)继续培养。分别于培养24、48、72 h时，将96孔板转移至超净工作台中，吸弃培养液，每孔加入CCK，继续培养1 h后取出96孔细胞培养板，放入酶标仪中，波长设定为450 nm，检测各孔吸光度(OD)值。以对照孔平均值调零，按照以下公式计算细胞存活率及抑制率：细胞存活率(%)=各浓度天冬多糖孔OD值/空白对照孔OD值×100%。生长抑制率(%)=1-细胞存活率。半数抑制浓度(IC50)为细胞存活率达到一半时的药物作用浓度，非毒性剂量(IC20、IC10)为细胞存活率分别达到80 %、90 %时的药物作用浓度。

1.4 细胞分组及干预方法 超净台内，消化贴壁细胞，按照计算出的天冬多糖IC50(2 480 μg/mL)、IC20(992 μg/mL)、IC10(496 μg/mL)分别作为高、中、低浓度干预HepG2细胞，作为天冬多糖高浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖低浓度组，空白对照组不干预。均用完全培养基配制成 2×104/mL的细胞液。在低氧培养箱(95%N2，5%CO2，1%O2)中培养24 h。

1.5 HepG2细胞迁移能力检测 采用Transwell法。将各组细胞加入 Transwell小室的上室，每孔150 μL。制备含10 μg/mL Fibronectin和15%血清的培养液，加入Transwell 小室的下室，每孔600 μL，放于培养箱中孵育24 h后取出Transwell小室，泡入4%多聚甲醛中10 min，10%结晶紫30 min。用湿润的卫生棉棒轻轻抹去膜上面的细胞，将小室倒置。显微镜下拍照、计数穿过Transwell小室PVPF膜的细胞个数，以穿过的细胞数评价迁移能力。

1.6 HepG2细胞侵袭能力检测 采用Transwell法。超净台内，将Matrigel 基质胶(提前用DMEM培养基稀释至一定浓度)，加入Transwell小室的上室(每室50 μL)，过夜风干；次日，超净台内，将培养液加入小室，每孔100 μL，室温静置 90 min，而后弃上清液，完全去除 Martigel；消化贴壁细胞，将各组细胞加入Transwell小室的上室，每孔150 μL。制备含10 μg/mL Fibronectin和15%血清的培养液，加入Transwell小室的下室，每孔600 μL，放于培养箱中孵育24 h后取出Transwell小室，泡入4%多聚甲醛中10 min，10%结晶紫30 min。用湿润的卫生棉棒，轻轻抹去膜上面的细胞，将小室倒置。显微镜下拍照、计数穿过Transwell小室PVPF膜的细胞个数，以穿过的细胞数评价侵袭能力。

2 结果

2.1 不同浓度天冬多糖对低氧条件下HepG2细胞的生长抑制作用 不同浓度、不同作用时间的天冬多糖对HepG2细胞均有明显的生长抑制作用。细胞生长抑制率与天冬多糖浓度呈正相关(r=0.980，P<0.05)，随着天冬多糖的浓度升高，HepG2细胞的生长抑制率增加，具有剂量依赖性。见表1。

表1 不同浓度天冬多糖对低氧条件下HepG2细胞的生长抑制作用

2.2 各组细胞侵袭能力比较 空白对照组、天冬多糖低浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖高浓度组分别有(196±5)、(91±6)、(64±7)、(40±4)个细胞穿过Transwell小室PVPF膜，天冬多糖低浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖高浓度组的侵袭细胞数均低于空白对照组(P均<0.01)。见图1。

图1 不同浓度天冬多糖对低氧下HepG2细胞侵袭能力的影响(Transwell法，×200)

2.3 各组细胞迁移能力比较 空白对照组、天冬多糖低浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖高浓度组分别有(182±4)、(96±7)、(72±5)、(37±3)个细胞穿过Transwell小室PVPF膜，天冬多糖低浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖高浓度组的迁移细胞数均低于空白对照组(P均<0.01)。见图2。

3 讨论

据统计，每年有65万人死于肝癌，其中我国原发性肝癌患者死亡人数约占全球的50%以上。虽然已有多种方法治疗肝癌，但肝癌的预后较差，患者动脉化疗栓塞(TACE)术后5年生存率仅为10%左右[9]，其中的一个重要原因是肿瘤血管生成，导致肿瘤向其他脏器的侵袭转移。研究发现，实体瘤可通过细胞保护机制在缺氧条件(又称低氧条件，指限制细胞获得氧气的肿瘤高细胞密度)下生存，这些保护机制包括诱导血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Bcl-2、MMPs等表达的转录因子激活，以及有利于细胞增殖、血管新生和多药耐药的葡萄糖重新编码机制等。低氧是实体肿瘤微环境特征之一，与肿瘤发展、浸润、转移等恶性生物学行为密切相关，是导致肿瘤治疗失败和预后不良的重要因素[10]。低氧时，肝癌细胞可通过诱导多种血管生成相关因子刺激血管的新生，促进肿瘤细胞的生长，如胰岛素样生长因子Ⅱ和VEGF，成为促进肿瘤生长的重要原因之一。肝TACE治疗中晚期肝癌栓塞肿瘤血管时，如果栓塞不完全，可使肝内局部形成缺血缺氧微环境，促进大量炎症介质和细胞因子的释放，从而导致肝癌的复发和转移。因此，对低氧条件下抑制肝癌细胞侵袭、转移能力进行研究，对于减少肝癌的复发转移具有重要意义。

图2 不同浓度天冬多糖对低氧下HepG2细胞迁移能力的影响(Transwell法，×200)

中医药在恶性肿瘤的综合治疗中有着重要的作用。与西医化疗药相比，中药具有不良反应小、安全性高、多途径、多靶点、适用范围广等治疗特点。天冬始载于《神农本草经》，列为上品，性甘、苦、寒，具有杀三虫、去伏尸的功效。肝癌患者多为阴虚，而天冬是滋补阴虚的良品，可以保护阴液、肝阴, 另外天冬还有抗菌等作用[11]。近年研究发现，天冬具有明确的抗肿瘤作用，已在临床上用于治疗乳腺癌、白血病、淋巴瘤等。天冬多糖由天冬经脱蛋白提取而成，除具有抗癌作用外，还具有提高机体免疫力、保肝益肾的功效，既有驱邪之功，又有扶正之效。研究发现，天冬多糖对正常细胞尤其是造血细胞不具有损伤抑制作用或作用甚小，而有利于恶性肿瘤毒性的逆转，且能通过促进免疫细胞的增殖或提高免疫细胞的免疫应答，从而抑制肿瘤生长，对于放化疗、手术后或肿瘤本身造成的机体免疫低下有一定改善作用，并可减轻放化疗引起的不良反应[12]。将天冬多糖制成胶剂后，除了天冬多糖本身的抗肿瘤作用外，可同时起到栓塞肿瘤血管的作用。我们前期研究发现，经肝动脉给予荷肝癌大鼠动物模型精制天冬胶样制剂进行栓塞治疗，可明显下调肿瘤组织中VEGF的表达，抑制肝癌的血管新生，既减轻了不良反应，相对延长了原位移植肝癌大鼠的生存时间，又起到抗血管生成和促进肿瘤细胞凋亡的作用，抗肿瘤作用温和[13]。本研究发现，不同浓度的天冬多糖对低氧条件下的人肝癌细胞均有明显的生长抑制作用，且细胞生长抑制率与天冬多糖浓度呈正相关，具有剂量依赖性，提示天冬多糖对低氧下肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用，且随着天冬多糖的浓度增加，对细胞的生长抑制更加显著。

迁移和侵袭是恶性肿瘤的重要特征，肿瘤细胞转移与侵袭的能力，依赖于细胞外基质降解的能力，而低氧条件可大大影响细胞的黏附和侵入。近年研究表明，中药可以通过激活相关miRNA而抑制其靶基因的表达，抑制肿瘤的侵袭与转移，最终影响肿瘤的发生发展[14]。抗癌药物提取的有效成分芹黄素可引起尿激酶、纤维酶原激活因子的表达下降，降低尿激酶活性，抑制基质金属蛋白酶分泌，显著抑制肿瘤细胞的侵袭转移[15]。本研究发现，天冬多糖低浓度组、天冬多糖中浓度组、天冬多糖高浓度组的侵袭、迁移细胞数均低于空白对照组，提示天冬多糖能有效抑制低氧条件下人肝癌细胞的侵袭和迁移，可能与其发挥抗肿瘤作用有一定关系。

综上所述，天冬多糖对低氧条件下人肝癌细胞的生长有明显的抑制作用，并能有效抑制人肝癌细胞的侵袭与迁移，为进一步研究天冬多糖抗肿瘤的机制奠定了实验基础。