中草药预混料对罗非鱼生长性能和免疫抗病力的影响

巩华，刘春花，赵长臣，孙承文，黄志斌*，陆文雄，龚钜财

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380；2.饶平东泽生物科技有限公司，广东 潮州 515700)

中草药预混料对罗非鱼生长性能和免疫抗病力的影响

巩华1，刘春花1，赵长臣1，孙承文1，黄志斌1*，陆文雄2，龚钜财2

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东 广州 510380；2.饶平东泽生物科技有限公司，广东 潮州 515700)

为探究复方中草药预混料在罗非鱼养殖上的生物学功效和经济效益，分别按0.50和5.00 g/kg的剂量添加配成实验饲料，在实验室内饲喂实验鱼3周，然后观察中草药预混料对罗非鱼(Oreochromisspp.)的生长、代谢及抗病力的影响；按0.25 g/kg投喂量在室外600 m2水泥池中进行两次120 d的养殖实验，每20天检查鱼体重、存活率等，并作成本效益分析。结果显示，与对照组相比，投喂中草药预混料的罗非鱼生长性能差异极显著(P<0.01)；血液指标中，血清尿素氮、肌酐略有升高，谷草转氨酶、血清总蛋白、谷氨酰胺合成酶基本保持原有水平，谷丙转氨酶下降，各组罗非鱼血液指标变化差异均不显著(P>0.05)，显示该组方的安全性较高。药物有效率实验显示，使用0.50 g/kg中草药预混料对罗非鱼无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)感染有极显著(P<0.01)的治疗作用。室外养殖全过程使用剂量为0.25 g/kg，两次实验的存活率分别提高4.6%和6.5%，增产8.8%和13%，600 m2实验塘产量比对照塘增产93.7 kg，用药费用减少120元，效益比率为1∶11。结果表明，本实验使用的中草药预混料能够有效促进罗非鱼生长，对代谢机能无明显影响，并能够有效地提高免疫保护率，产生良好生产效益。[中国渔业质量与标准，2017,7(2):43-49]

罗非鱼；中草药；生长；免疫调节；成本-效益分析

罗非鱼(Oreochromisspp.)属鲈形目、隆头鱼亚目、鲡鱼科、罗非鱼属，主要在广东、海南、广西和福建等地养殖。近年来病害日益突出，尤其是2009年暴发链球菌病，严重影响产业发展。目前主要采用磺胺类药物防治该病，虽磺胺类为国标药物，但易产生耐药，使用剂量越来越大，引起药物残留，增加了产品质量安全风险[1]。因此，替代抗生素药物研究具有重要意义。

中草药具有成本低、副作用小、使用安全、应用范围广的特点，含多种多糖、甙类、生物碱、有机酸、挥发油以及微量元素等，无抗药性、无药物残留、无环境污染、不引发药源性疾病，且抑菌杀菌效果明显[2]，华南地区开始使用中草药防治罗非鱼链球菌病[1,3]。张意敏等[4]发现在饲料中添加鱼腥草为主要成分的复方中草药制剂后，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的白细胞吞噬百分比、吞噬指数和血细胞呼吸爆发活力、血清溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、一氧化氮含量显著提高，血清丙二醛含量显著降低，增强了鱼体非特异性免疫力。Jufen等[5]利用血清溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等免疫指标，以及头肾、脾脏的细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA表达等作为指标，揭示了中草药影响尼罗罗非鱼对嗜水气单胞菌抵抗力的原理。中草药可作为饲料添加剂促进生长，提高抗病力。黄文庆等[6]研究表明在基础饲料中添加黄芪、金银花、苦参、紫花地丁等20多种中草药可以有效提高罗非幼鱼的增重率、特定生长率、蛋白质含量，降低饵料系数和粗脂肪含量。张倩倩等[7]研究发现，以玉屏风散为中草药饲料添加剂能够有效促进罗非鱼生长，对其非特异性免疫指标以及免疫相关基因表达均有不同程度的促进作用，并能够有效地提高草鱼的免疫保护率。汤菊芬等[8]研究表明复方中草药具有降低罗非鱼死亡率，促进生长和提高免疫力等作用。

本实验研究了罗非鱼饲料中添加中草药预混料(水产用新能量)，评估罗非鱼的血液指标、生长性能和抗病等，核算使用成本，以期为中草药在罗非鱼养殖中应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

中草药预混料(水产用新能量)由饶平东泽生物科技有限公司提供，主要为仙草、菊花、夏枯草、甘草、金银花、黄芪、板蓝根、银杏叶、穿心莲散剂与菠萝叶的提取物等。

健康罗非鱼，90～110 g，购自广东省佛山市三水某养殖场。

实验用无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)取自中国水产科学研究院珠江水产研究所水产动物病害与免疫研究室。

1.2 实验管理

用高锰酸钾消毒处理500 L方形塑料水族箱，自来水洗净后加入400 L水，曝气48 h，测得pH7.3，溶解氧7.89 mg/L。实验期间控制水温(28±1)℃，每天吸污换水1次，7:00、11:30、18:00投喂饲料，日投喂总量为体重的3%。

驯养(投喂日常饲料)1周后，选择规格整齐、健壮活跃、无病伤的实验鱼，随机分为3组，分别为对照组、低量组(0.50 g/kg)、高量组(5.00 g/kg)，每组设3个平行，每个平行30尾。空白组投喂日常颗粒饲料，实验组按剂量在日常颗粒饲料基础上添加中草药，连续投喂21 d。

表1 日常饲料组成Tab.1 The percentage composition of daily feed %

1.3 血液指标检测

实验正式开始前(0 d)和开始后7、21 d从各实验组随机取5尾罗非鱼，尾动脉取血，置于15 mL无菌离心管中4 ℃过夜，3 000 r/min离心30 min后，-20 ℃保存上清，采用试剂盒检测血清总蛋白(total serum protein, TSP)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和肌酐(serum creatinine, SC)含量，及谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)和谷草转氨酶(glutamic oxalocetie transaminase, GOT)活力。上述检测试剂盒均购自南京建成生物技术研究所，严格按照其说明书进行操作。

1.4 生长性能评价实验

以1.2方法设置实验组，实验开始随机抽取30尾鱼测量初体重，实验结束后称量每组实验鱼，测定末体重，并计算生长性能。

净增重(net mean weight，NW)=末体重(final mean weight，FW)-初体重(initial mean weight，IW)

增重率(weight gain，WG)=NW/IW×100%

特定生长率(specific growth ratio，SGR)=(lnFW-lnIW)/天数×100%

1.5 药物有效率实验

实验开始前，对实验罗非鱼肌肉注射无乳链球菌进行攻毒预实验，80%以上发生病症但不引起死亡的浓度定为实验菌液浓度。使用该浓度的菌液肌肉注射实验组及阳性对照组罗非鱼1次，对照组注射等量的灭菌生理盐水，注射前后停止投喂1 d。攻毒第2天起，实验组连续7 d投喂中草药预混料饵料，日投喂总量为体重的3%，对照组与阳性对照组投喂普通饵料。停药后观察1周，以体表特征、游泳活动恢复正常为标准，统计有效率。有效率(%)=症状好转动物数/发病动物数×100%。

1.6 室外实验

分别在4月、8月进行，鱼塘规格20 m×30 m，水深1～1.5 m，设实验池和对照池各1个，各放90～110 g/尾的罗非鱼2 000尾。饲养过程中，池水pH7.5～8，水温24～30 ℃，每池配备1.5 kW增氧机1台。

放鱼第1天随机称取30尾鱼，计算初始平均体重，以后每20天各组随机称取30尾罗非鱼，监测不同时期的鱼体质量，估算池塘鱼体总重。每日巡池2次，观察鱼体摄食、活动情况，将死亡鱼体及时捞出登记，统计存活率。

将中草药预混料按1∶100比例与常规饲料充分均匀混合，每天定点投喂2次，投喂量为每20天所估算鱼体总重的2%，添加剂量为0.25 g/kg；对照池以常规饲料投喂。实验结束时统计鱼体总质量，测定饵料系数(FCR)。

生产结束后，按照参考文献[9]进行成本效益分析。

1.7 数据处理

实验数据以平均值±标准差( Mean±SD)表示，用Origin8.0软件进行方差分析、显著性及相关性检验，以P<0.05为差异显著水平，以P<0.01为差异极显著水平。

2 结果与分析

2.1 中草药预混料对罗非鱼血液指标的影响

如表2所示，饲喂正常日粮或含中草药预混料的日粮7、21 d后，虽然其中高剂量连续投喂21 d，GPT下降幅度相对较大，但经统计分析各组罗非鱼血液指标变化差异均不显著(P>0.05)，可见对肝脏等功能影响不大，显示该组方的安全性较高。

表2 中草药预混料对罗非鱼血液指标的影响Tab.2 Effect of herbal premix on blood indexes of Oreochromis spp. n=3

注：数据表示为平均值±标准差，同列数字上不标注表示无显著性差异，标*表示与对照组差异显著(P<0.05)，标**表示与对照组差异极显著(P<0.01)。下同。

2.2 生长性能评价

整个实验期间，各组罗非鱼活力良好，未出现死亡，鱼体健康，反应灵敏，在摄食和游水等方面的活动无明显差别。实验开始时随机抽取30尾鱼测量初体重，实验结束后称量每组实验鱼测定末体重，计算生长性能指标如表3。可见，实验结束时，与对照组相比，投喂中草药预混料实验组中罗非鱼体重增加，低量组的净增重为(34.7±3.2) g、增重率为(35.01±2.81) %、特定生长率为(1.36±0.07) %，均分别与对照组的相应参数差异极显著(P<0.01)；高量组的净增重为(31.3±2.8) g，增重率为(29.56±3.04) %、特定生长率为(1.18±0.11) %，均分别与对照组的相应参数差异显著(P<0.05)。

2.3 抗病性能评估

对照组的实验鱼活动未见任何异常，鱼体健康，反应灵敏。对实验罗非鱼肌肉注射无乳链球菌进行攻毒预实验，80%以上发生病症但不引起死亡的浓度为6.5×105cfu/mL。感染链球菌的第1天，阳性对照组和实验组88.9%以上的罗非鱼体色发黑，精神萎靡，游动缓慢，严重者眼球突出，眼睛白浊、出血；连续给药7 d后，各药物剂量组实验鱼活力明显增强，摄食行为增加，中草药预混料对治疗罗非鱼细菌感染的有效率如表4所示，使用0.5 g/kg对罗非鱼无乳链球菌感染有极显著(P<0.01)的治疗作用。

表3 中草药预混料对罗非鱼生长性能的影响Tab.3 Effect of herbal premix on the growth performance of Oreochromis spp.

表4 中草药预混料对罗非鱼细菌感染有效率的影响Tab.4 Effect of herbal premix on the bacterial infection efficiency of Oreochromis spp. %

注：—示无。

2.4 室外实验结果

室外实验过程中，中草药预混料饲喂罗非鱼的效果见图1、图2及表5。实验表明，经120 d饲养，4月份的养殖实验中实验组存活率为79.8%，对照池存活率为75.2%，提高4.6%。实验池罗非鱼每尾平均体重482 g，比对照池每尾平均体重465 g增重3.7%；每600 m2实验池产鱼763 kg，对照池产鱼701.6 kg，增产鱼61.4 kg，增产8.8%。8月份的养殖实验中实验组存活率87.8%，对照池81.3%，提高6.5%；实验池的平均体重499 克/尾，对照池477 克/尾，快长4.6%；成鱼产量，每600 m2实验池实收1 095 kg，对照池969 kg，增产鱼126 kg，增产13%。实验组饵料系数为1.2，对照池饵料系数为1.4。

2.5 成本核算

室外实验表明，600 m2水面使用中草药预混料的实验塘的产量要比对照组增加93.7 kg，而使用的药费减少120元，则每公顷可以节约用药费用2 000元。2015年罗非鱼价格较低，两次实验养成鱼的批发价均为6.4元/千克，但使用本预混料依然能获得1 ∶11的效益(表6)，每公顷可以增加净收入14 283.3元。此外由于少发病，池塘消毒少，一般在池塘中混养的花白鲢产量相对较高，也能增加部分收益。由于本实验在水泥池中进行，未混养花白鲢，因此在大池塘中使用本预混料，效益可能更高。

图1 0.25 g·kg-1中草药预混料投喂罗非鱼室外养殖实验的死亡率Fig.1 The outdoor mortality rate (%) of fed Oreochromis spp. with the dose of 0.25 g·kg-1 Chinese herbal premix

图2 0.25 g·kg-1中草药预混料投喂罗非鱼室外养殖实验的日增重量Fig.2 The outdoor weight gain results of fed Oreochromis spp. with the dose of 0.25 g·kg-1 Chinese herbal premix

表5 0.25 g·kg-1中草药预混料投喂罗非鱼对饵料系数(FCR)的影响Tab.5 Effect of Chinese herbal premix at 0.25 g·kg-1on the feed rate of Oreochromis spp. culturen=2

组别Group项目Item投喂时间/d Feedtime20406080100120实验池饵料系数1.41.41.21.21.11.2投饲料量/kg108236367533726952鱼积累体重/kg77.3166299464646795对照池饵料系数1.51.51.31.31.31.4投饲料量/kg108237367521707934鱼积累体重/kg74154299414547670

表6 罗非鱼室外养殖全过程添加使用的成本效益分析Tab.6 Effect of herbal premix on the cost benefit analysis of Oreochromis spp. culture

注：*示计算结果以600 m2池塘核算表述。

3 讨论

中草药不但能提高鱼类的特异性及非特异免疫功能[4-5,10]，防治鱼病，而且还能促进动物的机体代谢和蛋白质以及酶的合成，促进动物的生长[6-8]，提高营养物质的利用率，降低饵料系数，在广东、海南[1,3]等地被应用于实际生产中，因此研究适用、有效、安全的中草药免疫增强剂及其最佳投喂剂量和模式是目前最重要的内容[2]。

3.1 对生长代谢的影响

血液蛋白含量与营养和代谢都有关系[11]。实验结果表明血清总蛋白(TSP)含量在实验期间无明显变化，表明机体蛋白代谢受影响较小。蛋白代谢主要在肝脏中进行[12]，血清谷氨酰胺合成酶(GS)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GPT)是以酶原的形式存在肝细胞中，是重要的蛋白代谢酶，常因肝细胞破裂或细胞膜变化而引起大量释放，使血液中酶浓度升高[13]，因此也是肝脏功能重要血液指标。蛋白在鱼体内代谢成尿素氮，经肾脏排出体外。罗非鱼的药物主要经肝、肾代谢[14]，而BUN和SC是考察肾脏排泄功能指标，广泛应用于临床。从本实验结果来看，与对照组相应参数相比，低量组净增重差异极显著(P<0.01)，高量组净增重差异显著(P<0.05)，可见该预混料的促生长效果明显；TSP、GS、GPT、GPT、BUN和SC水平都无显著变化，可见对肝、肾等实质性器官的功能无影响；在投喂过程中，饲料系数一直处于正常水平，显示该中草药预混料具有很好的安全性。

3.2 对免疫与生长的影响

鱼体免疫力影响饲料中营养物质转化，目前有两种意见。Drangsholt等[15]报道相比于未免疫鱼，接种疫苗的鱼生长快、饲料转化系数低；而Koskela等[16]则认为免疫力强的鱼种比免疫力弱的鱼种生长速度慢、饲料转化系数高，因免疫力强的鱼需将更多营养物质转化为抗体。这些差异可能与实验水温、投喂剂量、实验鱼品种、大小以及品系等不同有关系[5,17]。在一定范围内，饲喂高剂量的免疫增强剂，可短时间内提高机体免疫能力，而低剂量的免疫增强剂则需要长时间使机体免疫力有所提高；但若饲喂的免疫增强剂的剂量过高，可使机体产生免疫抑制现象，从而导致免疫力降低[2]。在罗非鱼养殖添加中草药，有的有显著提高，也有不明显，这可能与复方中草药配方和养殖环境不同有关[4-8]。在本实验中，罗非鱼在水泥池中饵料系数低的添加组，死亡率也低，显然整体的免疫力与饵料转化成正比，可能中草药激发机体免疫力的方式与疫苗不同，需进一步探讨。

在本预混料中的中草药为免疫增强剂，同时又有清热、补益类的中草药，能显著促进罗非鱼生长，提高罗非鱼成活率，对链球菌也有很好的防治作用，而且对肝肾等代谢器官机能未产生明显影响。综合比较投喂不同剂量的罗非鱼的成活率可知，该种中草药在0.50～5.00 g/kg的范围内都有效。在罗非鱼生产中使用该种中草药治疗无乳链球菌感染肝损伤时，建议推荐剂量为0.50 g/kg，长期保健可减半使用，即0.25 g/kg。

3.3 生态经济效益评价

本实验表明，在罗非鱼养殖过程中，以0.25 g/kg的剂量全程使用该种中草药，可以降低饵料系数，明显改善罗非鱼对营养成分的吸收率，减少排泄物对水环境的污染，发挥中草药生态调节功能。由于投喂的大量饲料转化成系统中的能量，还能提高水体中作为二级消费者的滤食性鱼类的产量[18]，提高社会经济效益，达到增产增收的目的。此外，使用本品可以减少抗生素的使用，降低药物残留，每公顷水面可减少用药2 000元，有积极的环保意义。

本组方中使用了菠萝叶提取物。菠萝叶是果实收获后的废弃物，据《中华本草》记载菠萝叶有消食和胃、止泻舒缓的功能，其提取物含酚类、酰胺类、三萜类等化合物，具有较好的抗氧化、抗菌和驱虫活性[19]，其中菠萝叶酚对家兔高血脂表现出降甘油三酯的作用，且有一定的量效关系，有治疗高脂血症作用[20]。在本实验中菠萝叶提取物的添加，改善了组方效果，拓展了这类农业废弃物的使用渠道。

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Effects of herbal premix on the growth performance andimmune function of tilapia (Oreochromisspp.)

GONG Hua1,LIU Chunhua1,ZHAO Changchen1,SUN Chengwen1,HUANG Zhibin1*,LU Wenxiong2,GONG Jucai2

(1.Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sceience, Guangzhou 510380, China;2.Raoping Dongze Biological Technology Co. Ltd., Chaozhou 515700, China)

In order to investigate the biological effects and economic benefits of Chinese herbal premix in tilapia culture, herbal premix doses of 0.50 and 5.00 g/kg were added respectively into the experimental diets to feed fish in laboratory experiments for 3 weeks. Then the effects of traditional Chinese medicine premix on tilapia (Oreochromisspp.) in terms of growth, metabolism and disease resistance were observed; breeding test for 120 d were carried out twice in 600 m2cement pond outdoors, and fish weight, and survival rate were checked every 20 d, and then cost benefit analysis was valued. The results showed that tilapia had significant difference in growth performance (P<0.01) after feeding premix when compared to the control group, and these blood indexes, such as serum urea nitrogen, and creatinine increased slightly; aspartate aminotransferase, serum total protein glutamine synthetase maintained the original level; alanine aminotransferase decreased. The difference in changes of all the blood indexes of each group of tilapia were not significant (P>0.05) after premix feeding, which showed the premix was highly safe. The prescription drug efficiency experiment results showed that after using the dose of 0.50 g/kg, the tilapia infection againstStreptococcusagalactiaehad significant therapeutic effects(P<0.01). And the outdoors breeding experiment with the dose of 0.25 g/kg was carried out twice. The survival rate of outdoor experiment increased by 4.6% and 6.5%, and the yield increased by 8.8% and 13% respectively; the average yield in the 600 m2experiment pond was increased by 93.7 kg, drug costs reduced by 120 yuan, and profit ratio was 1∶11. These results showed that the Chinese herbal premix used in this experiment can promote the growth of tilapia effectively, but had no obvious effect on metabolism, and can effectively improve the immune protection rate, and generate good productivity effect.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(2):43-49]

Tilapia(Oreochromisspp.); herbal premix; growth performance; immune regulation; cost benefit analysis

HUANG Zhibin, hzb1393@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.02.008

2016-09-19；接收日期：2016-12-02

国家科技支撑计划课题(2012BAD25B02)；广东省应用型科技研发专项资金项目(2016B020234003)

巩华(1977-)，男，助理研究员，硕士，研究方向为鱼类病害免疫防控，gonghua18@126.com 通信作者：黄志斌，研究员，研究方向为鱼类病害免疫防控，hzb1393@163.com

S94

A

2095-1833(2017)02-0043-07