溶剂及其体积分数对6种肺癌细胞的细胞毒作用

董芳蕊，臧诗蕾，黎莉莉，郭纪全，臧林泉

(1.广东药科大学中药学院,广东 广州 510006；2.广东省人民医院呼吸科,广东 广州 510080；3.广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

溶剂及其体积分数对6种肺癌细胞的细胞毒作用

董芳蕊1，臧诗蕾1，黎莉莉1，郭纪全2，臧林泉3

(1.广东药科大学中药学院,广东 广州 510006；2.广东省人民医院呼吸科,广东 广州 510080；3.广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

目的 探索既能提高难溶性中药单体的溶解度，又对肿瘤细胞低毒或者无毒的有机溶剂及其体积分数窗口，阐明溶剂不同体积分数(volume fraction,VF)对模型化合物莪术醇药效作用的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝显色(MTT)法，研究二甲基亚砜(DMSO)和乙醇两种有机溶剂对人恶性肿瘤细胞A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1等细胞活力的影响和毒性作用，并进一步研究用不同体积分数乙醇配制的莪术醇对A549和NCI-H460的细胞毒作用及其差异性。结果 在48 h内，当DMSO体积分数(DMSO volume fraction，DVF)≤0.008时对A549无细胞毒作用；DVF≤0.004时对NCI-H1650无细胞毒作用；DVF≤0.002时对NCI-H460无细胞毒作用；然而，另外3种细胞NCI-H1299、LTEP-a2和SPC-A1 细胞则在DVF<0.001时即表现出一定的细胞毒性。在48 h内，当乙醇体积分数(ethanol volume fraction，EVF)≤0.004时对A549无细胞毒作用；EVF≤0.002时对NCI-H460和NCI-H1650无细胞毒作用；当EVF≤0.001时对NCI-H1299无细胞毒作用；对LTEP-a2和SPC-A1细胞则在EVF<0.001时即表现有一定毒性作用。当EVF低于0.01时乙醇对A549和NCI-H460无细胞毒作用，以其配制的莪术醇溶液对细胞活力的影响仅代表莪术醇的药效作用，由于EVF 0.01的乙醇比EVF 0.001的乙醇具有更好的助溶作用，又具有细胞毒作用，两细胞株细胞活力差异极大，分别从93.84%和95.67%降至35.35%和36.41%。结论 A549、NCI-H1650可以首选DMSO作为溶剂，NCI-H1299可以首选乙醇作为溶剂，NCI-H460可选择其中任一溶剂，而LTEP-a2和SPC-A1则不宜以DMSO或者乙醇作为溶剂。

MTT；细胞毒性；中药单体；溶剂；DMSO；乙醇；莪术醇

在体外筛选中，许多具有抗肿瘤作用的中药单体，往往由于其较差的水溶性而受到限制，此时常利用有机溶剂提高该中药单体的溶解度，以发挥良好的药效作用。关于溶剂选择讨论的已有大量报道，其研究对象多为肝癌[1]、消化道癌[2]以及黑色素瘤[3]等，对于肺癌细胞株实验中溶剂的选择的报道很少。然而肺癌作为目前发病率最大的恶性肿瘤之一，对人类健康造成了极大的威胁，有关针对肺癌药物的报道也层出不穷，却少见溶剂对肺癌的细胞毒作用研究。本文以实验室常用的溶剂DMSO和乙醇为代表溶剂[4-6]，对包括A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1在内的6种肺癌细胞进行了溶剂细胞毒作用研究。莪术醇是常见的具有抗肿瘤作用的难溶性中药单体，在本研究中将作为模型化合物被使用。

二甲基亚砜(DMSO)作为极性溶剂，能与大多数有机溶剂互溶，被誉为“万能溶剂”，它对于细胞膜亲和力强，能够帮助难溶性中药单体通过细胞膜，促进药物的吸收利用[7]，体积分数10%的DMSO可用于细胞低温冻存，但是冻存过程的时间必须较短，否则细胞活性将明显降低[8]；乙醇作为最为常用的低毒溶剂之一，常被用于提高难溶性单体在培养基中的溶解度。然而无论因DMSO或是乙醇，超过一定浓度都必然会对细胞产生毒性作用，而不同细胞对不同种类的有机溶剂及其不同浓度的敏感性必然具有差异。

本文旨在考察6种肿瘤细胞对DMSO和乙醇的耐受范围，和最大耐受浓度，为难溶性中药单体在细胞水平的干预试验提供浓度参考；以难溶性中药单体莪术醇[9]为模型药物，探讨乙醇浓度对其药效影响。

1 实验材料

1.1 肿瘤细胞系 人肿瘤细胞A549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1，购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，在本实验室保存培养。

1.2 仪器 显微镜(广州湘仪)；超净工作台(SW-CJ-2FD苏州净化)；CO2培养箱(Thermo)；酶标仪(Thermo)。

1.3 试剂 胎牛血清，R&S公司；RPMI 1640培养基，DMEM完全培养基，胰蛋白酶，青链霉素，均购自Gibco公司；MTT，美国Sigma公司；无水乙醇(生物纯)，二甲基亚砜(生物纯)，均购自阿拉丁试剂。

2 方法

2.1 细胞培养 将人肿瘤细胞NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2、SPC-A1和A549细胞株分别接种无菌细胞培养瓶中，加入适量含体积分数为0.10胎牛血清、体积分数为0.01青链霉素的RPMI 1640培养基或DMEM完全培养基，在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每1～2天换液。贴壁生长状态良好，处于对数生长期的细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，传代(以1 ∶2或1 ∶3比例传代)、冻存(DMSO ∶培养基 ∶胎牛血清=6 ∶3 ∶1)或展开实验。

2.2 MTT法检测不同浓度溶媒对细胞活力的影响 取对数生长期的细胞，接种于96孔板(细胞密度根据细胞不同，在3×107～5×107/L)，每孔100 μL；待细胞贴壁后弃去培养基，加入含0、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128、0.256(V/V)DMSO或者乙醇的无血清培养基，37 ℃，5% CO2条件下培养12，24和48 h后，每孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)，继续在37 ℃，5% CO2条件下孵育4 h，最终弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO，在摇床上震荡10 min，至蓝紫色结晶甲臜完全溶解，用酶标仪测定570 nm处每孔吸光度值(OD值)，实验重复4次。按照下面公式计算细胞相对活力：

细胞相对活力/%=实验组OD值/对照组OD值×100%[10]

2.3 MTT法检测不同浓度乙醇对莪术醇药效的影响 参照“2.2”实验方法，取对数生长期的A549和NCI-H460细胞，接种于96孔板(细胞密度为3×107/L)，每孔100 μL；待细胞贴壁后弃去培养基，加入含0、0.001、0.01、0.1(V/V)乙醇的无血清培养基和以含0.001、0.01、0.1(V/V) 乙醇的无血清培养基配制的100 μmol·L-1莪术醇药液，37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，按照“2.2”方法进行实验，并计算细胞相对活力。

2.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 6统计软件进行数据处理，采用t检验进行数据统计。

3 结果

3.1 两种溶剂对6种肿瘤细胞相对活力的影响 不同浓度DMSO及乙醇处理6种人肿瘤细胞12，24，48 h后，MTT检测细胞活力变化，当有机溶剂的浓度超过一定值以后，均表现出一定的时间和剂量的依赖性，然而针对不同细胞株却稍有差异。

A549细胞株对DMSO的敏感性高于乙醇，当DMSO的体积分数≤0.008时，A549细胞株的细胞活力在各时间点与对照组比较差异均无显著性，即在此浓度范围以下，DMSO对A549细胞活力无影响。当DMSO的体积分数与>0.008时，细胞活力随其浓度升高呈现明显的下降趋势，且与作用时间呈现负相关性，干预12、24和48 h的IC50分别为体积分数0.0893、0.0720和0.0522。乙醇干预12、24和48 h的IC50分别为0.0540、0.0392和0.0213。见Tab 1。

相较于A549细胞株对DMSO的敏感性高于乙醇，NCI-H460则呈现相反结果， DMSO干预12、24和48 h的IC50分别为0.0690、0.0336和0.0196。乙醇干预12、24和48 h的IC50分别为0.0707、0.0635和0.0310。当DMSO干预时间≤24 h，其体积分数≤0.008时，对NCI-H460细胞活力无明显影响，而乙醇在干预时间≤12 h时，体积分数可以达到0.016，而对细胞活力无明显影响。见Tab 2。

NCI-H1299对两种有机溶剂的敏感性均高于其他5种肿瘤细胞，DMSO和乙醇干预48 h的IC50分别仅为0.0098和0.0096。当作用时间≥24 h的情况下，体积分数0.001的DMSO即可以细胞活力产生明显影响，体积分数0.002的乙醇同样可以明显影响细胞活力。见Tab 3。

NCI-H1650对两种有机溶剂的敏感性均低于其他5种肿瘤细胞。DMSO干预12 h的IC50超过0.1。而作用时间≤12 h，乙醇体积分数低于0.016时，其细胞活力无明显影响，这一数据也低于其他细胞株数据。见Tab 4。

Tab 1 Effect of different volume fraction organic solvent on A549 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

Tab 2 Effect of different volume fraction organic solvent on NCI-H460 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

Tab 3 Effect of different volume fraction organic solvent on NCI-H1299 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

DMSO干预LTEP-a2细胞，12、24和48 h的IC50分别为0.0657、0.0149和0.0104，当干预时间超过48 h，体积分数0.001的DMSO就会对该细胞的细胞活力产生明显影响。乙醇干预12，24和48 h的IC50分别为0.0605，0.0241和0.0168，当干预时间超过24 h，体积分数0.001的乙醇亦会对该细胞的细胞活力产生明显影响。见Tab 5。

DMSO干预SPC-A-1细胞，12、24和48 h的IC50分别为0.0823、0.0412和0.0233，当干预时间不超过48 h，体积分数0.004以下的DMSO均对该细胞的细胞活力无明显影响。乙醇干预12、24和48 h的IC50分别为0.0507、0.0218和0.0134。见Tab 6。

Tab 4 Effect of different volume fraction organic solvent on NCI-H1650 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction of DMSO or ethanol=0)

Tab 5 Effect of different volume fraction organic solvent on LTEP-a2 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction DMSO or ethanol=0)

Tab 6 Effect of different volume fraction organic solvent on SPC-A-1 in cell viability(±s,n=4,%)

*P<0.05vscontrol group(volume fraction DMSO or ethanol=0)

3.2 不同浓度溶媒对药物细胞水平药效的影响 利用不同浓度的乙醇配制的培养基，溶解相同浓度的难溶性中药单体莪术醇，并与对照组(乙醇体积分数为0)，以及相同浓度的乙醇溶剂对照比较。

当以体积分数为0.001的乙醇作为溶剂溶解莪术醇时，莪术醇在溶剂中无法充分溶解，其对细胞的影响无法充分体现，然而当以体积分数为0.01的乙醇作为溶剂，虽然乙醇本身对细胞活力具有一定影响，但同时莪术醇对NCI-H460和A549的杀伤作用却得到充分的体现，两株细胞的活力分别从95.67%和93.84%降至36.41%和35.35%，如果将乙醇体积分数提高至0.1，溶剂本身带来的对细胞活力的影响过大，无法确证此时细胞活力的真正原因来自莪术醇或是乙醇。见Tab 7。

Tab 7 Effect of curcumol prepared with different volume fraction of ethanol on NCI-H460 and A549 in cell viability(±s,n=4,%)

4 讨论

许多具有良好药效的中药单体的水溶性很差，在实验过程中，为了达到实验目的，往往需要加入有机溶剂或者表面活性剂来提供溶解度，包括乙醇、DMSO、吐温-80，泊洛沙姆188等，其中表面活性剂如吐温-80，往往通过与细胞膜的作用提高药物的溶解度，因此在细胞水平实验过程中，对细胞的伤害较大[11]。因此作为难溶性中药单体在细胞水平实验中的重要角色，有机溶剂种类和浓度的选择至关重要。标准主要包括，能够保证药物的溶解度，且不与药物反应，同时对细胞毒性小。目前虽有一些文献报道[1-3,12]，但不同文献对DMSO或者乙醇的用量的结论并不统一，造成这种差异的原因可能包括，有机溶剂的生产厂商或批号不同，不同细胞对不同有机溶剂的敏感性不同。本文旨在为筛选对肺癌有效的难溶药物时提供溶剂参数。

本实验考察了两种有机溶剂对6种人肿瘤细胞的A 549、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-1650、LTEP-a2和SPC-A1细胞活力的影响，结果表明同一细胞株对不同溶剂表现出不同的敏感程度，而同一溶剂对不同细胞株的影响程度亦有较大差异，不同浓度的有机溶剂对同一细胞株的毒性也差别极大，同时还与细胞株被干预时长密切相关。针对难溶性中药单体，在溶剂本身浓度对细胞无明显影响的范围内，随着有机溶剂浓度的增大，药物的溶解度增加，药效随之增强。因此，对于不同的细胞株进行实验，有必要通过查阅文献或进行实验来确定溶剂的种类和浓度，以筛选出既能充分溶解难溶性中药单体，令其有效作用于实验细胞，又能对细胞活力影响最低的有机溶剂及其最佳浓度。

(致谢: 本研究是在广东药科大学药学院新药筛选与药效学评价中心完成，感谢实验室的各位同仁在实验中给予的极大帮助以及鼓励，令本实验能够顺利完成。)

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Effect of organic solvents on human lung cancer cells and effectiveness of curcumol

DONG Fang-rui1, ZANG Shi-lei1, LI Li-li1, GUO Ji-quan2, ZANG Lin-quan3

(1.CollegeofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;2.DeptofRespiratory,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3.CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Aim To explore the concentration range of organic solvent which can both effectively increase solubility of the difficult soluble medicine monomer, and have low toxicity to cells, and to clarify the influence of different concentration of ethanol on curcumol efficacy.Methods Different DMSO and ethanol concentrations were diluted in culture medium and incubated with cells A549, NCI-H460, NCI-H1299, NCI-1650, LTEP-a2 and SPC-A1 for 12 h, 24 h, or 48 h, cell viability was tested by a colorimetric assay with 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), and different concentrations of ethanol with/without different concentrations of curcumol were also prepared with culture medium, then incubate with A549 and NCI-H460 cells for 24 h, and cell viability was tested by MTT as well.Results Within 48 h the solution with 0.008(V/V) DMSO or less had no significant effect on the cell A549 compared with control group, for NCI-H1650 the concentration was 0.004(V/V) or less, for NCI-H460 the result turned to be 0.002(V/V) or less, and the solution with DMSO below 0.001(V/V) had significant effect on the three other cells, NCI-H1299, LTEP-a2 and SPC-A1. While within 48 h, the liquor with 0.004(V/V) ethanol or less did not exhibit significant cytotoxic effect on the cell A549, for NCI-H460 and NCI-H1650 the result of ethanol concentration became 0.002(V/V) or less, for NCI-H1299 the data was 0.001(V/V) or less, and the liquor with ethanol below 0.001(V/V) showed significant cytotoxic effect on LTEP-a2and SPC-A1. When the proportion of ethanol in solution was below 0.01, it has no cytotoxic on cell A549 and NCI-H460, and the curcumol solution prepared with this kind of ethanol solution only represented the efficacy of curcumol on the cells. Since the solution with 0.01(V/V) ethanol dissolved the curcumol better, the cell viability changed from about 100% to about 35%.Conclusions Different organic solvent expressed different toxicity to the same cell, and the sensitivity of different cells to one organic solvent is dissimilar. and DMSO could be the optimum solvent for A549 and NCI-H1650, while the optimum solvent of NCI-H1299 is ethanol, for NCI-H460 it could be both and DMSO and ethanol, and DMSO and ethanol is not suitable for LETP-a2, SPC-A1 to be solvent.

MTT;cytotoxicity;Chinese traditional medicine monomer;solvent;DMSO;ethanol;curcumol

时间：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.024.html

2016-12-17,

2017-02-15

广东省科技计划项目(No 2015A020211028)

董芳蕊(1986-)，女，硕士，研究方向：中药活性成分与新药研发，E-mail:imdongfangrui@163.com; 臧林泉(1965-)，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤药理学及多肽药物，通讯作者，E-mail: zanglq@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.012

A

1001-1978(2017)04-0506-06

R284.1；R287；R734.202.2