检测饲料中维生素B1含量的色谱条件优化

符金华， 姜文娟*， 杨琳芬， 邢 磊， 尹腾桂，王琤，金海虹， 樊 晶

（1.江西省兽药饲料监察所，江西南昌 330096；2.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013）

检测分析

检测饲料中维生素B含量的色谱条件优化

符金华1， 姜文娟1*， 杨琳芬1， 邢 磊1， 尹腾桂1，王琤韦华2，金海虹1， 樊 晶1

（1.江西省兽药饲料监察所，江西南昌 330096；2.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013）

本实验中检测饲料维生素B1含量是采用高效液相色谱法，通过建立国标法和优化法两种色谱条件进行检测，其中优化法色谱条件为：色谱柱：ZORBAX SB-C184.6×150 nm 5-Micron；流动相配比：流动相水相：甲醇=85∶15；流动相流速：1 mL/min；柱温：35℃；进样体积：8 μL；检测波长：249 nm。结果表明：优化法保留时间为7.3 min，而国标法保留时间为20 min，另根据所测线性关系得R值为0.999，重复性与精密度均符合要求。因此，优化法条件下对于维生素B1的测定具有快速高效，重复性好，灵敏度高，实用价值高等优点。

维生素B1；色谱条件优化；高效液相色谱法

目前检测维生素B1含量的方法有分光光度法、电化学法、薄层色谱法等，但是这些方法只适用于简单的如维生素片剂、谷物等样品的检测。若需检测成分复杂的饲料样品，上述方法均存在局限性。高效液相色谱法技术相对成熟，前处理步骤简单，对于操作技术要求并不是太高，并且可以一次性大批量检测。因此本实验建立不同高效液相色谱条件，测定饲料中维生素B1含量，通过比较获得更佳的检测条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂 硫胺素标准品—盐酸硫胺素、庚烷磺酸钠、甲醇、乙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、冰乙酸、三乙胺等试剂均为优级纯，含量不低于99.7%。

实验中所有用水均为超纯水，符合 GB/T 6682中1级用水规定。

1.1.2 仪器 不同规格棕色容量瓶若干；超声波提取器：AUTOSCIENCE AS3120 Ultrasonic Cleaner广州诺盾科学仪器有限公司；离心机：TGL—16G上海安亭科学仪器厂；滤膜：0.22/0.45 μm（水系有机PTFE）上海嘉措仪器设备有限公司；真空泵：巩义市英峡予华仪器厂；电子天平：JA10003上海宏衡实业有限公司；高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity（含紫外检测器，美国）。

1.1.3 样品 5%青年蛋鸡复合预混合饲料（A样）、10%后备母猪复合预混合饲料（B样）。

1.2 实验前处理

1.2.1 上机前处理 提取液：在1000 mL容量瓶中装入约700 mL超纯水，加入50 mg EDTA、25 mL乙酸、5 mL三乙胺，充分混匀后用超纯水定容，即得提取液水相。按水相∶甲醇=86∶14或85∶15作为不同色谱条件下维生素B1提取液。

流动相：在1000 mL容量瓶中装入约700 mL超纯水，加入50 mg EDTA、1.1 g庚烷磺酸钠（精确至0.001 g）、25 mL乙酸、5 mL三乙胺，充分混匀后用超纯水定容。调节 pH至 3.40±0.02，过0.45 μm滤膜超声脱气，即得流动相水相。

1.2.2 维生素B1标准溶液前处理 维生素B1标准贮备液：于100 mL棕色容量瓶中加入维生素B1标准品0.05 g与25%乙醇溶液，超声15 min待全部溶解，用乙醇溶液定容。此溶液浓度为500 μg/mL，置冰箱中低温保存。

维生素B1标准工作液：于50 mL棕色容量瓶中加入5 mL标准贮备液，用流动相定容。该标准工作液浓度为50 μg/mL，并以此梯度稀释5个浓度：50、25、20、5、1 μg/mL。

1.2.3 样品前处理 准确称取A样4.70 g、B样4.73 g（两种饲料分别称取两份平行样），再分别加入到100 mL棕色容量瓶中，并做好标记，加入适量提取液超声20 min，待冷却至室温后用提取液定容至刻度，12000 r/min离心12 min，转移至进样瓶中待上机。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件的选择

1.3.1.1 国标法 GB/T14701-2002标注的色谱柱为NoVa-pak C18（3.9×150 nm，4-Microm）；实验用色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6×150 nm，5-Microm）；流动相配比为流动相水相∶甲醇=86∶14；流动相流速为0.80 mL/min；柱温为28℃；进样体积为10 μL；检测波长为246 nm。

1.3.1.2 优化法 色谱柱为 ZORBAX SB-C184.6×150 mm 5-Micron；流动相配比为流动相水相∶甲醇=85∶15；流动相流速为1 mL/min；柱温为35℃；进样体积为8 μL；检测波长为249 nm；选用20 μg/mL维生素B1标准工作液分别在国标法和优化法的色谱条件下上机测定，比较相同浓度标准工作液在不同色谱条件下的测定结果，选出最适合的色谱条件。

1.3.2 线性测定 将1.2.2所得各种浓度的标准品溶液分别取20 μL注入液相色谱仪中操作，记录结果。

1.3.3 重复性测定 分别取1.2.3中所得同一种饲料样品的两份平行样溶液20 μL注入液相色谱仪中操作，记录其色谱图及所得数据。

1.3.4 精密度测定 连续取6份1.2.3中所得同种饲料中同一份平行样品溶液20 μL注入液相色谱仪中操作，记录其色谱图及所得数据。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确立 选用20 μg/mL维生素B1标准工作液分别在国标法和优化法的色谱条件下上机测定，根据两种条件下所得图谱可知：在优化法的色谱条件下峰成正态分布，峰形稳定，吸收最强，且干扰较少，保留时间短 （结果见图 1，为7.3 min）；而在国标法的色谱条件下，机械平衡十分不稳定，干扰非常大，峰形不明显，且保留时间较长（结果见图2，为20 min）。故本实验选择优化法色谱条件来测定维生素B1的含量。

图1 20 μg/mL维生素B1标准工作液色谱图（优化法）

图2 20 μg/mL维生素B1标准工作液色谱图（国标法）

2.2 线性范围 将1.2.2所得各种浓度的标准品溶液分别取20 μL注入液相色谱仪中分析，记录色谱图，以溶液浓度对峰面积进行线性回归分析，结果见表1，线性回归方程为y=20.20x+4.15，相关系数R=0.999。结果表明，维生素B1在1～50 μg/mL时，溶液浓度与峰面积线性关系良好。

2.3 样品的测定 取样品按照1.2.3中的方法对样品进行处理，按照1.3.1.2中的色谱条件进样测定，计算饲料中维生素B1的平均含量，测定结果见表2。

分析数据可知，对同一样品同时测定两次，由于实验中所测两种饲料样品中维生素B1的含量均小于5.00×102mg/kg，其中B样10%后备母猪复合预混合饲料两次所测的实际相对偏差为0.13%（见表2），远小于理论上所得结果的相对偏差±10.0%，表明该方法的重复性良好。

表1 不同浓度维生素B1标准工作液对应峰面积及其线性关系表

表2 饲料样品中维生素B1的测定结果

2.4 精密度实验 对该仪器进行精密度分析，取其中一种样品分析如B样10%后备母猪复合预混合饲料，结果显示其相对标准偏差 （RSD）为1.18%（n=6），表明仪器的精密度良好。

表3 饲料样品中维生素B1的精密度测定结果

3 讨论

3.1 实验前处理

3.1.1 提取液的选择 梁琳等（2016）研究表明，以水—甲醇—乙酸（RSD=0.33%）作为提取液比以流动相（RSD=0.55%）或水相（RSD=1.19%）作为提取液时，实验仪器精密度更高，因此本实验在饲料中提取维生素B1时，选用水—甲醇—乙酸作为提取液。

3.1.2 流动相的选择 参考李胜祥等（2009）和黄榕珍（2005）研究，若在试验中选择己烷磺酸钠代替庚烷磺酸钠作为流动相组成成分，发现所得色谱峰拖尾严重，峰形不佳，结果表明，选用己烷磺酸钠代替庚烷磺酸钠效果并不理想；另外，结合国家药品标准中有关维生素B1片物质检查流动相的选择与梁琳等（2016）的研究，发现流动相选择添加甲醇、乙酸、三乙胺与庚烷磺酸钠，并调节其pH为3.4左右时，经试验验证，用此流动相色谱峰峰形良好，保留时间缩短，即在很大程度上提高效率。

3.1.3 维生素B1标准溶液的保存 由于硫胺的不稳定性，遇热、紫外线、氧气都易分解或变质，而其在酸性溶液中很稳定（常温下pH一般为3.5）。因此本实验选择盐酸硫胺素作为维生素B1标准品。在配制过程中，必须使用棕色容量瓶且在避光环境下操作，否则会改变其性质，从而对实验结果产生影响。另外介于硫胺素的不稳定性，此次实验中所有标准液都必须现用现配，使用完毕后必须置于低温避光环境中保存，以便重复利用，但是必须保证不得超过三个月期限。

3.1.4 样品前处理 由于饲料中成分较为复杂，杂质色谱峰易形成干扰，因此在上机前必须对样品进行前处理，有利于分离目标物质，同时尽量减少对色谱柱的损害。另外在样品的提取过程中，采用超声波提取法而不是高温水浴提取法，这是由于在实验过程中发现，在超声波提取器中超声20 min，可以保证维生素B1充分溶解，说明该方法能够方便快捷的提取饲料中的维生素B1，提取效果好，并且可以减少人力物力，提高效率。

3.2 色谱条件选择

3.2.1 色谱柱的选择 一般对水溶性维生素进行分析时，采用C18色谱柱，其保留性强，分离效果好，本实验所使用的色谱柱同样为C18色谱柱，长150 mm，内径4.6 mm，粒度5 μm，比国标法标注的色谱柱内径和粒度都略大，可以承受更大的压力和流速，提高分析效率。实验证明，优化法条件下的色谱峰正态分布较好，柱效较高。

3.2.2 流动相配比的选择 当甲醇体积分数为20%时，保留时间长。吕慧卿（2008）比较流动相中水相与甲醇的配比，以保留时间和峰面积作为检测指标，研究发现，增加甲醇比例可以减少出峰时间，但是色谱峰分离度较差。综合考虑本实验中选用的甲醇体积分数为15%左右。

3.2.3 检测波长的选择 张权等 （2012）和梁琳（2016）研究表明，维生素B1在246 nm处有最大吸收波长，但其受杂质影响较大，而在250 nm处同样有较大吸收波长。因此本次实验中，优化法综合考虑选择249 nm为检测波长。

4 结论

本实验结果表明，对于大批量测定不同饲料中维生素B1含量时，采用优化法色谱条件进行检测，所耗时间更少，所得峰形更稳定，能准确的测定饲料中维生素B1的含量。为我们在使用不同型号的仪器设备时，优化色谱条件提供一定的参考。

[1]国家药典委员会.中中华人民共和国药典[S].二部，北京：中国医药科技出版社，2010：176.

[2]黄榕珍.高效液相色谱法测定甲硫氨酸维生素B1注射液中甲硫氨酸和维生素B1的含量[J].海峡药学，2005，17（5）：42～45.

[3]李胜祥，阚家义.复合维生素B注射液中4种维生素含量测定[J].安徽医药，2009，13（7）：755～757.

[4]梁琳，王英.HPLC法同步测定维生素预混合饲料中5种B族维生素[J].中国饲料，2016，1：21～23.

[5]吕惠卿.高效液相色谱-荧光检测法测定复合维B片中维生素B1含量[J].中国药业，2008，17（15）：24~25.

[6]张权，陈文生，洪亮.高效液相色谱法测定贵州不同产地大米中维生素B1含量[J].粮食与饲料工业，2013，12：56～58.

[7]赵艳，扬发树，刘耀敏，等.反相高效液相色谱法测定预混料中3种水溶性维生素[J].饲料研究，2015，1：55～57.■

This experiment established the high performance liquid chromatography（HPLC）method to detect the content of vitamin B1in feed.Two methods of national standard method and the optimization method are adopted.The optimization method of chromatographic conditions were：chromatographic column of ZORBAX SB-C184.6×150 nm 5-Micron，water phase flow of matched：mobile phase：pure methanol=85∶15，mobile phase flow rate of 1 mL/min，column temperature of 35℃，sample size of 8 μL，detection wavelength of 249 nm.The results showed that the retention time of optimization method for 7.3 min，and national standard method of retention time is about 21 min，the linear correlation coefficient R value is 0.999，repeatability and precision meet the requirements.It was concluded that the optimization method for the determination of vitamin B1was more practical，more fast and efficient，and had good repeatability，high sensitivity，etc.

vitamin B1；chromatographic conditions optimization；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2017）05-0031-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170507

*通讯作者