蜗牛酶辅助提取马勃多糖的工艺研究

王 华， 王 莹，詹长娟，王 翼， 徐 伟

（1.南京理工大学泰州科技学院 环境与制药工程学院，江苏泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院 动物药学院，江苏泰州225300）

蜗牛酶辅助提取马勃多糖的工艺研究

王 华1*， 王 莹2，詹长娟1，王 翼1， 徐 伟1

（1.南京理工大学泰州科技学院 环境与制药工程学院，江苏泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院 动物药学院，江苏泰州225300）

本试验以马勃多糖得率为评价指标，通过研究提取温度、时间、酶用量、pH对多糖提取率的影响，以单因素试验和正交试验设计优选最佳提取工艺条件。结果表明：蜗牛酶辅助提取马勃多糖的最佳提取工艺条件为提取温度35℃、提取时间120 min、酶用量5.0%、pH 6.0。在此条件下，马勃多糖得率为0.908%。与传统水提法相比，多糖得率提高了158.01%。由此可见，蜗牛酶辅助提取具有得率高、提取时间短、条件温和等优点。

马勃；多糖；蜗牛酶；提取

马勃，俗称马蹄包、马粪包、药包子等，是一种担子菌门真菌类中草药（郭晶，2013）。据中国药典（2015年版）记载，马勃具有清肺利咽、止血等功能。近年来，国内外大量科技工作者对马勃的化学成分进行了深入研究，发现马勃成分具有抑菌（郭晶，2013）、抗炎 （苏方华等，2010；左文英等，2004）、抗肿瘤细胞（崔磊等，2006）等药理作用，并从马勃中分离鉴定出了氨基酸盐类、三萜类、甾醇类化合物以及蛋白质、多肽、多糖、微量元素等成分（郭晶，2013；王晨英等，2002）。姜明华等（2014）和赵友生等 （2012）在马勃多糖抗肿瘤试验中发现，多糖组分对宫颈癌细胞、乳腺癌细胞及小鼠艾氏腹水瘤等具有较好的抑制作用。

本研究在传统水提法的基础上 （黄凯等，2008），通过蜗牛酶辅助提取马勃多糖 （马丽雅，2010），以马勃多糖得率为评价指标，比较温度、时间、酶用量、pH四个因素对提取情况的影响，再经正交试验优化提取条件，以确定最佳的提取工艺参数。

1 试验材料与方法

1.1 原料处理 将产自河北的马勃，经除杂，粉碎，烘干后，密封贮藏，备用。

1.2 试验仪器与试剂 HK-02A多功能粉碎机，上海烨昌食品机械有限公司；AL104电子天平，梅特勒-托利多；SHA-B双功能水浴恒温振荡器，金坛市杰瑞尔电器有限公司；UV754N紫外-可见分光光度计，上海精科仪器有限公司。

D-无水葡萄糖对照品 （110833-201506），中国食品药品检定研究院；蜗牛酶及生化试剂，上海金穗生物科技有限公司；其余试剂为市售分析纯。

1.3 试验方法与步骤

1.3.1 马勃多糖的提取 称取5.0 g马勃粉及一定量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入到锥形瓶中，将锥形瓶置于水浴恒温振荡器中，待体系温度稳定后，加入蜗牛酶溶液，经酶处理一段时间后，加入2 mL 30%三氯乙酸终止反应 （莫祺晖等，2015），抽滤，收集滤液，蒸发浓缩，冷却。将量为浓缩液的1.5倍，无水乙醇慢慢加入到浓缩液中并不断搅拌，静置40 min，抽滤，所得滤饼即为马勃粗多糖。将马勃粗多糖用蒸馏水溶解并定容至250 mL，得马勃粗多糖溶液。

1.3.2 马勃多糖的测定 本文采用苯酚硫酸法测定多糖的含量。根据池源等（2014）的方法，以吸光度（A486）为纵坐标，葡萄糖的浓度（C）为横坐标，绘制曲线。标准曲线方程：A=0.0055C+0.0045，R2=0.9996。结果表明，以该法测定葡萄糖的浓度，在60～140 μg/mL范围内具有良好的线性关系（见图1）。

图1 苯酚-硫酸法葡萄糖标准曲线

取马勃多糖样品溶液1 mL于10 mL的具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，加入硫酸5 mL，加蒸馏水至10 mL，摇匀，放置10 min，置40℃水浴锅中保温18 min，取出后冷却至室温，以相应的试剂为空白，在486 nm波长处测定其吸光度。

式中：C为根据标准曲线计算得到的多糖的浓度，μg/mL；V为马勃多糖溶液的体积，mL；n为稀释倍数；m为马勃粉质量，g。

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对马勃多糖得率的影响 称取马勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH 5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及1.5%酶液（共80 mL），分别在30、35、40、45、50℃下水浴提取60 min，结果见图2。

从图2中可看出，30～40℃，随着提取温度的不断升高，马勃多糖得率逐渐增大，35℃后尤为明显，当温度达到40℃时，多糖得率达到最大值，40℃之后，多糖得率明显降低，45℃后趋于平缓。温度升高，有助于蜗牛酶酶解效率的提高，使得马勃细胞壁的破坏速度加快，利于马勃细胞内多糖分子等扩散，但是温度过高，会使得大部分蜗牛酶结构，发生不可逆变性（肖冬光，2004）；此外，较高的温度亦会加快多糖糖苷键的裂解，从而降低马勃多糖的得率。

图2 提取温度对马勃多糖得率的影响

2.1.2 提取时间对马勃多糖得率的影响 称取马勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH值为5.5缓冲液及1.5%酶液（共80 mL），在40℃下分别水浴提取60、75、90、105、120 min，结果见图3。

图3 提取时间对马勃多糖得率的影响

从图3中可看出，随着提取时间的增加，多糖得率不断提高，当提取时间超过90 min后，多糖得率趋于稳定。这是因为提取时间延长，马勃细胞的破坏程度加剧，胞内多糖能更多的扩散至提取液中。

2.1.3 酶用量对马勃多糖得率的影响 称取马勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH值为5.5缓冲液及分别加入 1.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%酶液（共80 mL），在40℃下水浴提取60 min，结果见图4。

从图4中可看出，随着酶用量的不断增加，多糖得率也逐渐增大，当酶用量为1.5%～4.5%时，多糖得率增大的速度较快；再增加酶用量多糖提取率趋于平缓。蜗牛酶是纤维素酶、甘露糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等混合酶（袁久刚，2014），可分解真菌细胞壁中的葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等物质。酶量增加，可迅速破坏细胞壁结构，有助于多糖的提取。

图4 酶用量对马勃多糖得率的影响

2.1.4 提取pH值对马勃多糖得率的影响 称取马勃粉5.0 g，共5份，每份中分别加入pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的缓冲液以及1.5%酶液 （共80 mL），在40℃下水浴提取60 min，结果见图5。

图5 提取pH值对马勃多糖得率的影响

从图5中可看出，缓冲液pH值为5.5时，多糖得率较高，pH过高或过低，多糖得率都会下降，可能与蜗牛酶生物活性受到一定程度的影响有关。此外，pH过低会破坏多糖分子中的糖苷键（宋晓凯，2010），将多糖分子裂解为小分子寡糖甚至单糖，进一步降低多糖的得率。

2.2 正交试验优化马勃多糖的提取工艺 根据单因素试验结果选定因素水平，以提取温度（A）、时间（B）、酶用量（C）以及提取pH（D）作为研究对象，采用L9（34）表，设计正交提取试验，通过对正交试验结果进行分析，优化最佳提取工艺。

2.2.1 因素与水平 根据单因素试验的结果，设计正交试验，四因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

2.2.2 试验结果的分析与讨论 正交试验结果与分析见表2。

表2 正交试验设计及结果

由表2中各因素极差可知，四个因素对于试验结果的影响强弱依次为：D＞B＞A＞C（pH＞时间＞温度＞酶用量）；最佳提取工艺条件为：提取温度35℃、提取时间120 min、酶用量5.0%、pH 6.0（A2B3C1D3）。

2.2.3 最佳提取工艺条件的验证 由表3可知，在优化工艺条件下，马勃多糖的平均得率达到0.908%，试验结果进一步说明该提取工艺条件能够达到预期目的。

2.3 最佳工艺不加酶对照试验 按最佳工艺条件，即提取温度35℃、提取时间120 min、pH 6.0，在此条件下，直接进行马勃多糖的提取（蜗牛酶添加量为0），马勃多糖得率为0.352%。

表3 验证试验结果

3 结论

本文研究了蜗牛酶辅助提取马勃多糖的最佳提取工艺。在单因素试验的基础上，应用正交试验优化了蜗牛酶辅助提取马勃多糖的提取条件，最终确定最佳的提取工艺条件为：提取温度35℃、提取时间120 min、酶用量5.0%、pH 6.0，在此条件下马勃多糖的得率为0.908%；最佳工艺不加酶的对照试验中多糖得率仅为0.352%，多糖得率提高了158.01%。试验结果表明，蜗牛酶破壁能力很强，能够有效地提高马勃真菌类多糖的提取效率，缩短提取时间，并且提取条件温和，能耗低，故此法可为马勃的综合利用提供参考。

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To optimize the snailase-assisted extraction process of polysaccharides from puffball，the optimum extraction conditions were established by single-factor experiment and orthogonal analysis with polysaccharides yield as an index.The optimum extraction conditions were as follows，snailase addition was 5.0%，and pH 5.0 for 120 min extraction at 35℃，the average yield of polysaccharides was 0.908%.The yeild of polysaccharides was 158.01%higher than water extraction method.The snailase-assisted extraction method has the advantages of high yield，short extraction time and mild condition.

puffball；polysaccharide；snailase；extraction

S816.11

A

1004-3314（2017）05-0024-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170505

*通讯作者