细菌的获得性耐药机制研究进展

张泽辉，宋雪娇，黄程程，金安妍，田春莲，张德显，刘明春

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

文献综述

细菌的获得性耐药机制研究进展

张泽辉，宋雪娇，黄程程，金安妍，田春莲，张德显，刘明春*

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866)

抗菌药物的广泛使用，导致细菌耐药性日益严重，耐药菌所致的感染给人类健康及畜禽生产带来巨大威胁。细菌耐药可由多种机制所介导，研究细菌的耐药机制对防止或延缓耐药性的产生具有重要意义。近年来，影响药物与作用靶位结合及作用靶位结构变化等机制介导的耐药受到人们的关注。论文将对作用靶位变化导致细菌耐药问题的最新研究进展进行综述，以期为防止和延缓细菌耐药性的产生提供理论依据。

细菌耐药机制；作用靶位；阻止结合；外排作用；结构改变

抗菌药物是治疗细菌性疾病的首选药物。然而，多药耐药细菌所致的感染在全球范围内迅速增加，如何应对细菌的耐药性问题成为研究热点。随着研究的深入，逐渐被发现一些介导细菌耐药的新机制。如添加于食品、化妆品中用于抗菌的三氯生对细菌具有广泛的杀灭作用，但是对革兰阴性菌假单胞菌无效，起初认为是该菌能够将三氯生排出菌体外，减少了三氯生和酰基ACP还原酶的结合，而产生耐药性；但是最新的研究表明，假单胞菌体内能够产生其他构型的酰基ACP还原酶，竞争性与三氯生结合而产生耐药性。因此，准确掌握细菌的耐药机制对临床合理选用抗菌药物及开发新型抗菌药物具有重要意义。

1 阻止抗菌药物与作用靶位蛋白结合

1.1 降低细胞膜对抗菌药物的通透性

细菌能够降低自身细胞膜对抗菌药物的通透性，这是革兰阴性菌产生耐药性的重要机制。除了一些水溶性的抗菌药物能够通过外膜孔蛋白进入革兰阴性菌菌体外，绝大多数抗菌药物不能透过菌体外膜。大肠埃希菌的外膜孔蛋白(如外膜孔蛋白OmpF和OmpC等)对抗菌药物的通透性具有非特异性，前期研究认为抗菌药物是能够与孔蛋白内的药物结合位点结合而进入菌体内。近年研究表明，这些水溶性药物水解后能够与孔蛋白表面的H-键结合后进行转运[1]，因此，孔蛋白OmpF和OmpC空间结构的改变不是介导细菌耐药的机制，而是由于孔蛋白OmpF和OmpC在细菌外膜表面的数量减少导致抗菌药物进入细菌的量减少而出现耐药性。此外，有研究表明，假单胞菌和不动杆菌等肠杆菌科能够下调孔蛋白的表达量而增强对碳青霉烯类和头孢菌素类等新药的耐受性[2-4]。碳青霉烯类药物广泛用于肠杆菌属细菌引起的感染，在定向选择的压力下编码孔蛋白基因的突变增加，进而使肠杆菌属细菌对该类抗菌药物产生耐药性的风险增加[5]。另外，肺炎克雷伯杆菌能够产生孔蛋白OmpK35和OmpK36的异构体而对碳青霉烯类抗菌药物产生耐药性。

1.2 外排泵的外排作用

革兰阴性菌的外排泵系统可以将多种抗菌药物外排至菌体外而产生耐药性。外排蛋白产生的量越高，外排泵系统所介导的耐药性也就越强。某些外排泵只能对特定的药物有外排作用(如Tet外排泵)，而多药耐药(multidrug resistance,MDR)外排泵可以对多种药物有外排作用。在近3年中，发现了一些新的外排泵系统，包括突变链球菌的MdeA系统、嗜麦芽窄食单胞菌的FuaABC系统及肺炎克雷伯杆菌的KexD系统等[6-7]。细菌染色体上携带多个能够编码多药耐药外排泵的基因，但是一些细菌能够将这些基因转移至质粒上而在细菌间进行传播。研究人员在弗氏枸橼酸杆菌的质粒IncH1中发现新型耐药结节细胞分化家族(resistance nodulation division，RND)外排泵系统基因，该基因能够编码产生新德里金属β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-β-lactamase1，NDM1)，这有可能导致该耐药质粒在其他病原菌中广泛传播，而引起针对β-内酰胺类抗生素的广泛耐药[8]。

多药耐药外排泵系统中的RND家族蛋白是导致革兰阴性菌耐药的重要因子之一，RND家族蛋白高表达时能够引起革兰阴性菌的多重耐药。RND家族蛋白介导的外排泵系统是位于菌体内膜由3个相同多肽组成的三聚体，通过形成含有周质调节蛋白如AcrA或MexA和外膜通道如TolC或OprM的共聚物，来与抗菌药物结合形成共结晶化物质，阻止抗菌药物进入菌体内[9]。一些研究表明，大肠埃希菌的周质调节蛋白AcrB含有两个结合位点，通过调节自身结构来适应药物的结构和分子质量大小等，而介导多种抗菌药物的耐药性[10-11]。

多种细菌如假单胞菌、肠杆菌和金黄色葡萄球菌等通过高表达外排蛋白产生耐药性[12]，明确外排蛋白高表达的机制对开发新药具有重要意义。编码外排蛋白的基因受到整个菌体调节系统的调控，常见的菌体调节系统包括AraC-XylS家族转录调控因子MtrA和RamA等，前者能够提高淋病奈瑟菌的转录启动子mtrCDE的转录水平[13]，而后者则能激活沙门菌acrAB-tolC的转录；同时，菌体调节系统AraC-XylS家族的表达往往又受到抗菌药物耐药蛋白家族(MarR)的影响，如大肠埃希菌marA和鼠伤寒沙门氏菌的ramR都能影响抗生素耐药蛋白家族(MarR)的表达；另外，肠杆菌属中的MarA、SoxS、RamA或者Rob蛋白的高表达能够诱导外排蛋白的表达水平升高，进而引起细菌多重耐药性的产生。

外排蛋白表达量的增加也可能是菌体对外界环境的刺激而产生的应激反应。如大肠埃希菌和沙门菌感染过程中产生吲哚类物质能够刺激的acrAB基因的高表达，然而，淋病奈瑟菌的转录启动子MtrCDE和金黄色葡萄球菌的多重耐药转运蛋白NorA的表达量跟宿主内环境中的铁离子浓度有关[14-15]。目前普遍认为，外排泵基因的表达跟转录调节蛋白密切相关，转录调节蛋白结构的研究对了解细菌产生耐药性的机制具有重要意义。通过分析结核分支杆菌TetR家族中转录调节蛋白Rv1219c的结构和功能，证实Rv1219c能够调节ABC家族转运蛋白RV1217c-Rv1218c的表达，而RV1217c-Rv1218c与异烟肼和利福平的外排有关。国内外相关研究人员正深入研究Rv1219c，期待以其作为新的药物结合靶点研制新药。此外，沙门氏菌的负调控蛋白RamR能够调节ramA基因的表达，采用抑制物抑制RamR和菌体DNA的结合后，ramA基因的表达量增加，进而降低外排蛋白的表达[16]。研究影响外排泵蛋白表达的转录调控因子有利于临床开发具有抑制外排泵表达的新型药物，为临床使用新型药物和抗菌药物提供可能。

2 抗菌药物作用靶位结构的改变

2.1 基因突变引起的作用靶位的改变

抗菌药物能够特异性的与菌体内的作用靶位结合，从而阻止细菌正常的生命活动，而发挥抗菌作用。作用靶位结构的改变能够影响抗菌药物的抗菌活性。细菌感染是1个包括大量病原菌参与的过程，药物的作用靶位往往是由多个等位基因编码产生的，但是如果其中1个编码作用靶位的基因发生突变而产生耐药性，该突变可以很快转移至其他等位基因。利奈唑胺是本世纪初应用于临床的一种抗菌药物，主要作用于革兰阳性菌的23S rRNA核糖体亚单位，该药广泛用于治疗肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌所引起的感染，但是最近发现编码利奈唑胺作用靶位的某个基因的核苷酸序列突变引起耐药，而这种突变迅速在其他等位基因上出现并加剧了利奈唑胺耐药。

细菌通过转化从外界直接整合外源DNA形成嵌合基因而导致作用靶位蛋白结构发生变化，进而产生耐药性。肺炎链球菌能够嵌合青霉素结合蛋白基因(penicillin-binding protein gene，pbp)而产生青霉素灭活酶，对青霉素类药物产生耐药性，通常认为肺炎链球菌的pbp基因从缓症链球菌中转化到肺炎链球菌的DNA中的。淋病奈瑟菌转化获得的penA基因能够编码产生青霉素结合蛋白(penicillin-binding protein,PBP)，能够对头孢菌素类抗生素产生高水平耐药。

外源等位基因的获得是细菌获得耐药性的一个重要方面，如对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌通常是获得了葡萄球菌染色体mec基因盒元件(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)而产生对甲氧西林的耐药性。mec基因盒的组成包括mec基因的复合结构、染色体核重组基因ccr以及J区。mecA基因是SCCmec上的重要基因，它属于耐药基因，区别于同在mec基因复合体上的抑制基因mecI和主管调节的mecRl基因。携带mecA基因的细菌可以编码产生能够耐受β-内酰胺类抗生素的PBP2a，而使细菌在含有β-内酰胺类抗生素的环境中继续合成细胞壁[17-18]。链球菌属中已发现了多种SCCmec元件，并且证明mecA等位基因可在链球菌属种不断转移。起初研究认为，包含有SCCmec元件的mecA基因是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的重要标志，但是，在奶牛和人的临床分离株中已经检测到mecA的突变体mecC，而mecC可能与mecA都是甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的标志。mecC的核苷酸序列与mecA的同源性为70%，并携带SCCmec Ⅺ型元件。临床检测甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌中mecA的PCR方法不适用mecC的检测，因此可能给临床检测带来一定的困难[19]。含有mecC的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的耐药谱与含mecA的菌株也呈现一定的差异：含有mecC的菌株比含有mecA的菌株对苯甲异噁唑青霉素敏感性要高，但是对头孢西丁的耐受性更强[10,20]。国内有相关报道表明，对头孢西丁和苯甲异噁唑青霉素耐药表型和mecA的基因型存在不一致，这可能由于环境因子影响，而对于mecC基因对细菌耐药性的产生还有待进一步探索。

2.2 修饰/保护作用靶位

细菌修饰/保护作用靶位是产生抗菌药物耐药性的重要途径。研究发现细菌保护抗菌药物作用靶位是临床多种抗菌药物产生耐药性的重要作用机制，如红霉素核糖体甲基化蛋白(Erm)家族能够改变16 S rRNA的药物结合位点，阻止大环内酯类和林可胺类抗生素与16 S rRNA的结合。氯霉素-氟苯尼考甲基化转移酶(chloramphenicol-florfenicol resistance methyltransferase,Cfr)能够使23 S rRNA的A2503发生甲基化，并由此而导致细菌产生对多种药物如林可胺类、酰胺醇类和截短侧耳素类抗生素的耐药性。这种保护抗菌药物作用靶位的机制可以和外排泵协同介导细菌对大环内酯类药物高水平耐药[21]。

在多种病原菌的质粒中发现喹诺酮耐药基因qnr，qnr基因能够编码产生能够结合并保护拓扑异构酶IV和DNA回旋酶的五肽重复蛋白(pentapeptide repeat proteins,PRPs)，五肽重复蛋白能够与拓扑异构酶-喹诺酮复合物相互作用，导致喹诺酮跟拓扑异构酶的结合性降低，降低了喹诺酮类药物的抗菌活性。

达托霉素能够作用于革兰阳性菌表面的磷脂阴离子，在钙离子的参与下，由于细胞去极化而致使细胞内的重要物质外流而呈现杀菌作用[22]。金黄色葡萄球菌的mprF基因突变可引起菌体细胞膜中磷脂分子的重组，进而改变细胞膜的电位，从而对抗达托霉素的去极化作用。达托霉素主要用于治疗肠球菌特别是屎肠球菌的严重感染，但是耐药菌株已经迅速出现，虽然具体的耐药机制还不清楚，但是有研究认为某些基因的存在跟达托霉素的抗菌活性密切相关。

3 结语

抗菌药物的广泛使用导致了细菌耐药性的广泛传播，也给疾病治疗、人体健康以及畜禽生产带来了极大的威胁。细菌耐药性特别是关于其机制的探讨受到人们的广泛关注，细菌耐药的新机制也不断被发现，基因组学、系统生物学和结构生物学的应用将有利于新的耐药机制的发现。细菌耐药机制的研究有利于消除已存在的耐药机制和抗菌药物的创新。

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Progress on Antimicrobial Resistance Mediated by Changes of Target Protein in Bacteria

ZHANG Ze-hui，SONG Xue-jiao，HUANG Cheng-cheng，JIN An-yan，TIAN Chun-lian， ZHANG De-xian，LIU Ming-chun

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)

Antimicrobial resistance in bacteria has been an increasing threat to human and animals.Many factors,including extensive use and unreasonable use in curing infection caused by bacteria,may contribute to the emergence of antimicrobial resistance.It is essential to control or delay the antimicrobial resistance for studying on the resistance mechanisms.Recently,many new mechanisms,for examples, the prevention of access to drug targets and changing in the structure and protection of a8ntimicrobial targets,have drawn public attention.In this paper,the latest progress on antimicrobial resistance caused by changing target as reviewed,it is beneficial for controlling or delaying the antibiotic resistance.

antimicrobial-resistant mechanism; target; prevention of combination between antimicrobial agent and target; effect of efflux pump; structural change

2016-04-11

国家自然科学基金项目(31201954,31272601)

张泽辉(1992-)，男，辽宁本溪人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究。*通讯作者

S859.7

A

1007-5038(2017)01-0074-04