坏死梭杆菌研究进展

孟祥玉，佟盼盼，冯二凯，陈立志*

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130122；2.吉林特研生物技术有限责任公司，吉林长春 130122 )



坏死梭杆菌研究进展

孟祥玉1,2，佟盼盼1,2，冯二凯1,2，陈立志1,2*

(1.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130122；2.吉林特研生物技术有限责任公司，吉林长春 130122 )

坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum，Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌，其致病因子包括内毒素、白细胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等，其中主要的致病因子是白细胞毒素。由坏死梭杆菌引起的疾病在不同国家和地区均有发生，鹿、羊等反刍动物感染坏死梭杆菌时表现为跛行，关节肿大，肝脓肿和腐蹄病，猪、马等动物感染坏死梭杆菌时主要表现为跛行，严重时继发其他细菌感染，对养殖业造成巨大损失；人类感染该细菌时表现为急性咽炎综合征(Lemierre's syndrome)。论文通过对国内外坏死梭杆菌及其疫苗研究和新型佐剂的开发进行综述，以期为该细菌疫苗的研制提供参考。

坏死梭杆菌；腐蹄病；疫苗

坏死梭杆菌(Fusobacteriumnecrophorum，Fn)是一种严格厌氧的革兰阴性多形态杆菌，在新鲜病灶和幼龄培养物中多呈长丝状，在固体培养基和老龄培养物中多为球状或短杆状。因此，显微镜下通常可以观察到有长丝和短杆两种形态[1]。坏死梭杆菌能够产生多种致病因子，如内毒素、白细胞毒素、蛋白水解酶类、血凝素和溶血素等[2]。由于坏死梭杆菌白细胞毒素的产量与导致动物产生脓肿的能力有关，因此，普遍认为白细胞毒素是坏死梭杆菌的主要毒力因子。坏死梭杆菌广泛存在于动物和人的口腔、胃肠道和泌尿生殖道中，经常引起动物的坏死性病变，是肝脓肿、腐蹄病、坏死性喉炎(犊牛白喉)和牛其他坏死性疾病的主要病原菌。临床上，坏死灶常局限于肢蹄部，严重的可在唇部、面部、消化道、生殖道、肝脏、肺脏见到坏死灶，其中肝脓肿多发生在育肥牛，而腐蹄病多发生在肉牛和奶牛，这两种疾病给牛的健康养殖造成了严重的损失。坏死梭杆菌也是人类急性咽炎综合征(Lemierre's syndrome)的重要病原菌，人感染该菌时多表现为咽炎和血液感染以及颈静脉血栓[3-5]，研究发现，坏死梭杆菌不仅会引起人的扁桃体炎，还会引起人的肺脏脓肿结节，神经影像检测显示在大脑中有多处脓肿和硬膜下积脓，并且在颅内吸收的脓肿液中可以检测到该菌[6]。

根据不同来源的坏死梭杆菌在固体培养基上的菌落形态差异，将其分为4种亚型，即A型、B型、AB型和C型。其中，C型坏死梭杆菌没有致病性，称为伪坏死梭杆菌，后来研究发现，该菌与变形梭杆菌同源；AB型坏死梭杆菌同时具有A型和B型坏死梭杆菌的生物学特性，通过16S RNA序列分析发现，AB型与B型的亲缘关系更近；A型坏死梭杆菌常见于牛、羊、鹿等动物的腐蹄病和肝脓肿病灶，具有血凝活性和溶血活性；B型坏死梭杆菌常见于反刍动物瘤胃内容物和人的急性咽炎综合征，血凝活性较弱。Shinjo等[7]比较了该菌的形态学特征和生化特性，结合细菌基因组GC含量和同源性，将A型和B型坏死梭杆菌重新命名为Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorum(Fnn亚种)和Fusobacteriumnecrophorumsubsp.funduliforme(Fnf亚种)。

1 坏死梭杆菌的毒力因子

坏死梭杆菌引发感染性疾病涉及到多种毒力因子的作用，包括白细胞毒素、内毒素、溶血素、血凝素、黏附素、血小板凝集因子、外膜蛋白、皮肤坏死毒素、细胞壁溶胶原等成分以及几种胞外酶，如DNase和朊酶类。这些毒力因子在细菌黏附宿主细胞侵入机体、逃避机体天然免疫防御以及形成感染等方面起着重要的作用。

研究发现，坏死梭杆菌的外膜蛋白(OMP)具有介导黏附牛肾上腺毛细血管内皮细胞的功能，并且Fnn和Fnf两个亚种的菌株都存在这种外膜蛋白[8]，由此可以推断，OMP可能是细菌侵入细胞的主要蛋白。研究人员通过提取纯化其他革兰阴性菌的OMP进行动物试验和ELISA检测抗体，发现该蛋白具有一定的免疫原性，可以引起动物机体产生抗体，结果为选择坏死梭杆菌抗原制备疫苗提供了参考。

内毒素是革兰阴性细菌细胞壁中的一种脂多糖成分，对宿主有很强的毒性，如给小鼠腹腔注射很快可以引起其死亡；给兔皮内注射，可引起局部皮肤坏死和红斑；内毒素可引起宿主发热、微循环障碍、内毒素休克及弥漫性血管内凝血等疾病，而且内毒素稳定耐热、抗原性弱。Baker B等[9]用小鼠巨噬细胞进行的研究表明，超低剂量的内毒素会引起慢性炎症，同时还可以引起蛋白的泛素化和线粒体融合蛋白1的降解，导致发动蛋白1的去磷酸化和激活细胞程序性死亡，所以内毒素在坏死梭杆菌的致病过程中发挥了重要的作用。Garcia等[10]用甲醛灭活的坏死梭杆菌外毒素和少量内毒素制成疫苗免疫牛，使牛的肝脓肿发病率降低了37%。但由于内毒素的毒性强，单独作为抗原制备疫苗可能会对机体造成较大的副作用，可以考虑用少许内毒素作为佐剂，用于提高疫苗的免疫效果。

白细胞毒素是一种蛋白毒素，天然的白细胞毒素是胞外蛋白，分泌量少，但是其致病性很强，可以明确标记白细胞表面的相关受体并与之结合，引起白细胞中毒、凋亡、造成动物机体的免疫力下降，形成腐蹄病；还可以和溶酶体外膜的受体蛋白结合引起白细胞毒素和该抗原内化入溶酶体中，引起溶酶体内容物释放的中断，并且白细胞毒素会作为第一个细菌毒素定位到溶酶体引起其功能的丧失。当坏死梭杆菌分泌的白细胞毒素进入动物机体细胞之后，会引起机体免疫功能下降，细菌再次分泌其他毒素后，机体无法产生足够的免疫力抵抗细菌，同时也增加了其他细菌感染动物机体的几率，容易造成混合感染，又由于机体溶酶体，如清除外来有害物质和受损细胞结构、降解营养成分、合成代谢等的部分功能丧失，细胞还可能因为营养物质不足导致功能性衰竭，最终引起细胞坏死。由于白细胞毒素的产量和肝脓肿严重性有关，其一直以来都被研究人员认为是坏死梭杆菌的主要致病因子。试验证明，接种含有白细胞毒素的细菌培养基滤出液可以明显降低牛腐蹄病的发病率[11-12]；Saginala S等[13]通过对坏死梭杆菌白细胞毒素苗敏感性试验效果的观察，发现白细胞毒素苗免疫有剂量依赖性，利用1 mL、2 mL和5 mL细菌培养基上清液制备疫苗免疫肉用牛，结果显示，1 mL上清液疫苗的保护率为60%，2 mL与5 mL上清液疫苗的保护率相同均为80%，因此可以得出结论，随着剂量的增加，其免疫效果越来越好，但是最高剂量为2 mL，而其中白细胞毒素的浓度并未测定；Narayannan S K等[14-15]研制出白细胞毒素基因工程疫苗，用原核表达的方法将白细胞毒素的5种多肽链(BSBSE,SX,GAS,SH和FINAL)进行表达与重组，并与佐剂乳化制成不同成分疫苗，同时与灭活菌体苗和灭活菌体培养基苗对照，发现重组的白细胞毒素疫苗免疫效果明显好于两对照组，并且含有BSBSE和SH肽链片段的疫苗产生的免疫保护效果最好。

2 坏死梭杆菌感染的发病情况

坏死梭杆菌广泛地存在于自然界之中，由于其感染的部位和途径不同，因此可引发不同症状的疾病。国内学者报道，感染坏死梭杆菌的动物有发生肝脏、肺脏脓肿的病例[16-17]。新疆、内蒙、西藏、青海、甘肃、四川、黑龙江、吉林、湖北、云南等省份均存在腐蹄病[18]；北美地区也有大角羊患腐蹄病的报道，并且已通过PCR方法对确诊[19]；研究人员对印度喀什米尔草原患蹄叉腐烂的养殖绵羊采样，坏死梭杆菌可以分泌特异的白细胞毒素，因此利用特异性引物可以进行PCR反应，得到白细胞毒素LktA特异性片段和16S rRNA方法进行菌种鉴定，确诊有坏死梭杆菌感染[20]。最初报道该细菌感染绵羊、山羊、牛，偶尔感染马[21]，之后又有报道猪也有感染坏死梭杆菌的，并出现跛行的症状[22]。

3 坏死梭杆菌疫苗研究及面临的问题

目前，国内还没有商品化的坏死梭杆菌疫苗，有研究人员已经开始进行坏死梭杆菌疫苗的研制，王克坚等[23]研制的鹿源坏死梭杆菌菌体裂解疫苗对鹿有一定的保护效果。前文中提到，国外研究人员利用白细胞毒素、外毒素以及内毒素等不同成分制备疫苗，均获得一定进展，但是利用含有内毒素等成分制备的疫苗可能对动物体产生较大的副作用，因此，制备亚单位疫苗具有很大的应用价值。但是在亚单位疫苗制作过程中仍然面临很多亟待解决的问题：白细胞毒素作为外分泌蛋白是最主要的致病因子，其分泌量非常低，在离心收集菌体时很容易丢失；多种致病因子属于外分泌蛋白或细胞壁成分，在获取胞内蛋白的过程中丢失，因此，抗原性物质量少甚至没有；选择可用的最佳佐剂与合适的抗原；坏死梭杆菌引起的疾病属于慢性感染性细菌病，在建立稳定的动物感染模型时半数致死量、最低发病剂量的测定；由于大部分自然感染该菌的病例中多数属于混合感染，并且坏死梭杆菌有不同的亚种，因此，在制备亚单位疫苗的时候还要考虑到交叉免疫的问题。综上所述，在坏死梭杆菌疫苗的研制过程中仍面临诸多问题和挑战。

4 前景及展望

据统计，1957年至2015年，我国共批准103个兽用细菌类疫苗，主要为常规的家畜家禽用疫苗，而大家畜、特种动物等用的疫苗非常缺乏。随着养殖业的不断发展，牛、羊等产业逐渐庞大，同时，鹿茸作为一种药用价值很高的药物，越来越受到研究人员的认可，鹿产业逐渐兴盛起来，因此，坏死梭杆菌亚单位疫苗研制的前景十分广阔。通过国内外学者对该细菌的不同毒力因子的研究，为疫苗制备时抗原的选择指明了方向。一些国外研制成功的疫苗，如外毒素和内毒素疫苗，白细胞毒素基因工程疫苗等成功的实例为国内研究人员制备坏死梭杆菌疫苗提供了可靠的研究依据。随着近几年新型疫苗佐剂的发现，如二氧化硅、维生素A和维生素E以及儿茶素中的黄酮类等，为研制出保护效果更好的坏死梭杆菌疫苗奠定了基础。

[1] 陆承平. 兽医微生物学[M].中国农业出版社，2001：297-298.

[2] 王克坚，张洪英，陈立志等. 致病性鹿源坏死梭杆菌分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报，2000，22(2)：84-87.

[4] Alfreijat M. A case of Lemierre's Syndrome with a brief literature review[J].J Infect Public Health.2016,9(5):681-3.

[5] Riordan T. Human infection withFusobacteriumnecrophorum(necrobacillosis), with a focus on Lemierre's syndrome[J].Clin Microbiol Rev，2007,20(4):622-659.

[6] Haddad N, Morris T, Dhillon R, et al. Unusual neurological presentation ofFusobacteriumnecrophorumdisease[J].BMJ Case Rep，2016,12:2016.

[7] Shinjo T, Fujisawa T, Mitsuoka T. Proposal two subspecies ofFusobacteriumnecrophorum(Flügge) Moore and Holdeman:Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorumsubsp. nov., nom. rev.(ex Flügge 1886),andFusobacteriumnecrophorumsubsp.funduliformesubsp. nov., nom. rev. (ex Hallé 1898)[J].Int J Syst Bacteriol，1991,41(3):395-397.

[8] Kumar A, Menon S, Nagaraja T G, et al. Identification of an outer membrane protein ofFusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorumthat binds with high affinity to bovine endothelial cells[J].Vet Microbiol，2015,176(1-2): 196 -201.

[9] Baker B, Maitra U, Geng S, et al. Molecular and cellular mechanisms responsible for cellular stress and low-grade inflammation induced by a super-low dose of endotoxin[J].J Biol Chem，2014,289(23):16262-16269.

[10] Nagaraja T G, Narayanan S K, Stewart G C, et al.Fusobacteriumnecrophoruminfections in animals: Pathogenesis and pathogenic mechanisms[J].Anaerobe，2005,11(4):239-246.

[11] Takeuchi S, Nakajima Y, Ueda H,et al. Hepatic abscess formation in cattle inoculated withFusobacteriumnecrophorum[J].Nihon Juigaku Zasshi，1984,46(3):339-344.

[12] Tan Z L, Nagaraja T G, Chengappa M M.Fusobacteriumnecrophoruminfections: Virulence factors, pathogenic mechanism and control measures[J].Vet Res Commun，1996，20(2):113-140.

[13] Saginala S, Nagaraja T G, Lechtenberg K F. Effect ofFusobacteriumnecrophorumleukotoxoid vaccine on susceptibility to experimentally induced liver abscesses in cattle[J].J Anim Sci，1997，75(4):1160-1166.

[14] Narayanan S K, Nagaraja T G, Chengappa M M, et al. Cloning sequencing and expression of leukotoxin gene fromFusobacteriumnecrophorum[J].Infect Immun，2001,69(9):5447-5455.

[15] Narayanan S K, Chengappa M M, Stewart G C, et al. Immunogenicity and protective effects truncated recombinant leukotoxin proteins ofFusobacteriumnecrophorumin mice [J].Vet Microbiol，2003,93(4):335-347.

[16] 刘明华，周 艳. 羔羊肝脓肿防治[J].四川畜牧兽医，2006(8)：57.

[17] 宋氏斌，王 涛，于洪泽.羔羊坏死杆菌病的诊治[J].畜牧兽医科技信息，2006(9)：45.

[18] 马利青，李 剑，宋忠武，等. 青海省牛羊“腐蹄病”发生特点及其综合防治[J].青海畜牧兽医杂志，2016，46(1)：41-45.

[19] Shanthalingam S, Narayanan S, Batra SA, et al.Fusobacteriumnecrophorumin North American Bighorn sheep (oviscanadensis) pneumonia[J].J Wildl Dis，2016,52(3):616-620.

[20] Farooq S, Wani S A, Hassan M N, et al. The detection of dichelobacter nodosus, andFusobacteriumnecrophorum, from ovine footrot in Kashmir, India[J].Anaerobe，2015,35(Pt B):41-3.

[21] Bennett G N, Hickford J G. Ovine footrot: new approaches to an old disease[J]. Vet Microbiol,2011,24:148(1):1-7.

[22] Zhou H, Dobbinson S, Hickford J G.Fusobacteriumnecrophorumvariants present on the hooves of lame pigs[J].Vet Microbiol,2010,141(3-4):390.

[23] 王克坚，刘晓颖，陈立志，等. 鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN(AB)94抗原的免疫原性[J].中国兽医学报，2002，22(5)：468-469.

Progress onFusobacteriumnecrophorum

MENG Xiang-yu1,2,TONG Pan-pan1,2,FENG Er-kai1,2,CHEN Li-zhi1,2

(1.InstituteofSpecialEconomicAnimalandPlantSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changchun，Jilin，130122,China；2.JilinSpecialResearchBiologicalTechnologyCo.，LTD.，Changchun，Jilin，130122，China)

Fusobacteriumnecrophorumis a kind of anaerobic Gram negative pleomorphic rod bacteria. Virulence factors were introduced inFusobacteriumnecrophorumincluding endotoxin, leukotoxin, platelet aggregation factor, hemagglutinin, and hemolysin. However, leukotoxin is considered to be the major virulence factor. Diseases caused byFusobacteriumnecrophorumbroke out in different areas of different countries, the ruminants,deer and sheep, show lameness, arthrocele, liver abscess and "footrot disease"when infected withFusobacteriumnecrophorum,while animals,swine and horses show lameness due to infection ofFusobacteriumnecrophorumand become susceptible to other bacterial pathogens, causing huge losses to the animal husbandry; while human infected with the bacteria show acute pharyngitis syndrome (Lemierre's syndrome). In this review,we collected data to summarize characteristics ofFusobacteriumnecrophorumand bacterial vaccines as well as new development of new adjuvants to provide theories from both home and abroad for the bacterial vaccine development.

Fusobacteriumnecrophorum; footrot disease; vaccine

2016-10-20

吉林省科技攻关计划项目(20150204073NY)

孟祥玉(1991-)，男，河北沧州人，硕士研究生，主要从事坏死梭杆菌亚单位疫苗研究。 *通讯作者

S855.12

A

1007-5038(2017)05-0086-04