牦牛隐性乳房炎病原菌的分离及鉴定

李小旭，刘 侃，张小琴，郝葆青*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.阿坝师范学院化学化工与生命科学系，四川 汶川 623002）

牦牛隐性乳房炎病原菌的分离及鉴定

李小旭1，刘 侃1，张小琴2，郝葆青1*

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.阿坝师范学院化学化工与生命科学系，四川 汶川 623002）

牦牛隐性乳房炎被认为是高原藏族地区牦牛奶产量低下的主要原因之一。探索和研究牦牛隐性乳房炎致病菌特性及流行病学特征，可为牦牛隐性乳房炎防治提供一定的依据。本试验采集了红原地区不同牧群牦牛的80份奶样，由体细胞数、pH值测定初步筛选出了30份疑似牦牛乳房炎奶样，然后对其进行培养观察及生化检测，分离并鉴定出了牦牛隐性乳房炎病原菌。结果显示：80份奶样中有28份为牦牛隐性乳房炎奶样，检出率为35%；细菌学检测表明，28份奶样中金黄色葡萄球菌占10.71%，无乳链球菌占25%，乳房链球菌占32.14%，停乳链球菌占17.86%，大肠杆菌占14.29%。

牦牛；隐性乳房炎；病原菌；奶样；分离；鉴定

本试验采集了四川省红原藏族地区的三个牦牛群的奶样，通过初步筛选后，在实验室对疑似牦牛乳房炎奶样分别进行了乳汁微生物学检测和生化鉴定，分离和检测出了引起该地区牦牛群隐性乳房炎的各种病原菌，并对其特性及流行特征进行了研究。

1 试验材料

1.1 奶样 80份奶样采自红原县龙日坝三个牦牛群中无明显临床型乳房炎特征的泌乳期牦牛。采样时用温水清洗乳房，75%酒精消毒乳头，弃掉头2～3把奶。每头采奶样10mL于灭菌离心管中，加盖封紧，标明牛号和日期，用液氮罐保存带回实验室检测。

1.2 仪器及设备 显微镜、高压灭菌器、恒温培养箱、超净工作台、接种环、平皿、试管等。

1.3 培养基及试剂 小牛血清肉汤、普通琼脂平板、血琼脂平板和斜板、兔鲜血琼脂平板、麦康凯平板、七叶苷血琼脂培养基、马尿酸钠培养基等，各种培养基均按常规方法配制[1]。试剂有草酸铵结晶紫、卢氏碘液、95%乙醇、番红复染液。

2 试验方法

2.1 乳汁pH值检测 乳汁pH值检测用麝香草酚兰检验法（BTB法）[1]，取平均值。

2.2 体细胞计数[1-2]牛乳体细胞计数（SCC）用改进的显微镜计数方法测定，4个大方格内的全部体细胞按顺序计数。公式：细胞总数/4×10000×稀释倍数=每1mL乳汁中的细胞数。

2.3 病原菌增菌及分离培养 将SCC初步筛选的各奶样稀释100倍，摇匀，分别用微量移液器吸取100μL于小牛血清肉汤中，37℃下增菌培养24～28h。取出后再接种于普通琼脂平板、血平板和麦康凯平板上培养24～48h，观察菌落形态和生长情况。然后分别涂片、革兰氏染色、镜检，挑取各奶样中占优势的病原菌落于肉汤（含100mg/L葡萄糖）内进行纯化培养，供进一步鉴定。

2.4 病原菌鉴定

2.4.1 溶血试验 分别将28份疑似乳房炎奶样的纯化培养液直接接种于兔鲜血琼脂平板上，37℃培养24h，观察其溶血现象。

2.4.2 麦康凯鉴别培养 观察麦康凯培养基上各奶样中菌落的生长情况。对于无菌落生长的奶样，重新接种培养24h后再观察结果。

2.4.3 糖酵解试验 取疑似含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌奶样的肉汤液100μL分别接种到血琼脂平板或斜板上培养18～24h。然后按照常规方法分别进行甘露醇、果糖、山梨醇、木糖醇、尿素等生化试验，观察并记录结果。

2.4.4 链球菌鉴别试验[3]除了已鉴定为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的奶样外，其余奶样的肉汤液都分别取100μL接种于马尿酸钠培养基、七叶苷培养基、甘露糖和山梨醇培养基中培养观察，记录结果。

2.4.5 CAMP试验[4]在兔鲜血琼脂平板上接种1条金黄色葡萄球菌的划线，与此线垂直但不要接触，二者距离3～5mm处接种疑似链球菌病奶样的肉汤增菌液50μL，37℃温箱培养24h，观察结果。

3 结果

3.1 乳汁pH值检测和体细胞计数结果 采集的80份奶样中，SCC超过10万个/mL的样品有30份，结果见表1。

表1 pH值检测和体细胞计数结果

统计分析显示，奶样的SCC与pH值的相关系数r不显著（P＞0.05），表明乳腺组织的损伤程度不很严重，这与牦牛隐性乳房炎病变的体征相吻合。体细胞数是牦牛乳房健康状况的一项重要指标，也是奶质量的一项重要指标。一般认为，当牦牛患隐性乳房炎时，其乳汁中的SCC可达到10～15万个/mL左右[1]。因此，本试验以SCC超过10万个/mL作为初步判断隐性乳房炎奶样的标准。

3.2 病原菌的分离培养 对普通琼脂平板和血平板上生长的不同菌落分别进行涂片、革兰氏染色、镜检，其结果如下：有呈革兰氏阳性的链球状和葡萄串珠状的球菌；有呈革兰氏阴性的链球状球菌和大小不一的正直杆菌。由菌落形态和生长情况可初步判断病原类属有葡萄球菌、链球菌和杆状菌等。

3.3 溶血试验 30份疑似乳房炎奶样在鲜兔血琼脂平板上培养的结果及溶血试验结果详见表2。

根据培养后菌落形态、生长特性及溶血试验结果可大体上区分出21份奶样为链球菌，3份奶样为金黄色葡萄球菌，4份为大肠杆菌和其他杆菌，2份无明显菌落生长。

溶血试验的血琼脂培养基可见到三种溶血现象。一般而言，对红细胞具有溶血能力的细菌有α、β、γ三种类型。α溶血为对称绿色溶血型，此型不产生定型的溶血现象，在37℃培养24h后，于血液平板的深处形成绿灰色的菌落，其周围有不透明的绿色轮晕。β溶血可在血液平板上的菌落周围形成无色透明的溶血环，其直径有时超过菌落的直径。γ溶血又称非溶血型，在血液平板的菌落周围不产生溶血现象。链球菌属于α溶血，以此可作为确定链球菌的依据。

表2 金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌培养特性

3.4 麦康凯鉴别 试验结果显示，7份奶样的菌株生长良好，而21份奶样的麦康凯培养基不见或仅见少许菌落生长。由于链球菌类病原菌不在麦康凯培养基上生长，由此推测在此培养基上生长良好的7份奶样疑似为除链球菌以外的其他病原菌。

3.5 糖酵解试验 将上述试验中疑似金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等病原菌的7份奶样进行糖酵解试验，其结果见表3。

鉴别结果表明，7份奶样中有3份为金黄色葡萄球菌感染的奶样，4份为大肠杆菌感染的奶样。

3.6 链球菌分类鉴别 将上述3.2和3.3结果中21份疑似链球菌奶样分别进行相关鉴别试验，结果见表4。从表4可知，21例奶样病原菌中，无乳链球菌有7例，乳房链球菌有9例，停乳链球菌有5例。

表3 糖酵解试验结果

表4 马尿酸钠、七叶苷、甘露糖、山梨醇试验

引起隐性乳房炎的链球菌主要为无乳、停乳和乳房链球菌三种类型。马尿酸钠试验可将无乳链球菌、乳房链球菌与停乳链球菌分开，因为无乳和乳房链球菌可在其培养基上出现极易鉴别的紫色环。甘露糖、山梨醇、七叶苷培养试验是乳房链球菌的鉴别试验，以培养基变棕黑色为主要特征。

3.7 CAMP试验 试验结果显示，21份疑似链球菌病奶样中，只有7份奶样在有金黄色葡萄球菌产物存在或在两种细菌交界处的β溶血力增加,出现箭头型溶血区。表明这7份奶样为无乳链球菌，该试验结果与马尿酸钠、七叶苷、甘露糖、山梨醇试验结果相吻合。

4 结论

本文对红原地区80份牦牛奶样中的病原菌进行了初步筛选，检出28份疑似牦牛隐性乳房炎奶样，检出率为35%。28份疑似病原菌奶样的细菌学检测结果显示：金黄色葡萄球菌有3份（10.71%），无乳链球菌有7份（25%），停乳链球菌有5份（17.86%），乳房链球菌有9份（32.14%），大肠杆菌有4份（14.29%）。表明牦牛奶样中的病原菌以链球菌属的分离率最高（75%），大肠杆菌和葡萄球菌的分离率都相对较低。由此可知，引起高原藏族地区牦牛隐性乳房炎的主要病原菌为链球菌属，包括无乳链球菌、乳房链球菌和停乳链球菌。笔者认为，引起牦牛隐性乳房炎的环境链球菌的感染可能是放养牦牛产奶量低的主要原因之一。■

[1]GB/T 4789.28-2013.食品安全国家标准：食品微生物学检验：培养基和试剂的质量要求[S].北京：中国标准出版社，2014.

[2] Svennersten-Sjaunja K.Evaluation of quality changes in udder quarter milk from cows with low-to-moderate somatic cell counts[J].Animal，2010，4（4）：617-626.

[3]遇培芝，刘军，赵丽君，等.奶牛乳房炎链球菌的分离与鉴定[J].畜牧与饲料科学，2006（3）：34-36.

[4] Smith A J，Kitt A J，Ward P N，et al.Isolation and characterization of a mutant strain of Streptococcus uberis，which fails to utilize a plasmin derived βcasein peptide for the acquisition of methionine[J].J App Microbiol，2002，93（4）：631-639.

Isolation and Identification of Yak Subclinical Mastitis Pathogenic Bacteria from Milk Samples

Li Xiaoxu1，Liu Kan1，Zhang Xiaoqin2，et al.
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041；2.Department of Chemistry，Chemical Engineering and Life Science，Aba Teachers College，Sichuan Wenchuan 623002，China）

Yak subclinical mastitis is considered one of the primary causes for decreasing the milk yield of yak in Tibetan plateau。It has great practical significance that explore and research the characteristic of pathogenic bacterium and epidemiology characteristic，could provide certain basis for the prevention of yak subclinical mastitis at Hongyuan Tibetan area.In this study，80 milk samples were collected from three different herd in Hongyuan county，30 milk samples were screened as suspected yak subclinical mastitis by milk somatic cell count and pH value.Afterwards，the suspected milk samples were cultivated for observation，biochemical identification，and other further testing.The results showed that，28 milk samples were subclinical mastitis in the 80 milk samples，its detection rate was 35%.Bacteriological tests indicated that among the 80 milk samples，staphylococcus aureus was account for 10.71%，streptococcus agalactiae was account for 25%，streptococcus uberis was account for 32.14%，streptococcus dysgalactiae was account for 17.86%，Escherichia coli was account for 14.29%。

Yak；Subclinical mastitis；Pathogenic bacteria；Milk sample；Isolation；Identification

S858.234.43

B

1001-8964（2017）03-0036-03

2016-12-25

李小旭（1992-），女，辽宁人，硕士研究生，研究方向：基础兽医。

*通讯作者：郝葆青（1956-），男，四川人，硕士生导师，教授，博士后，研究方向：基础兽医。