载体介导的幽门螺杆菌NAP疫苗研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学 附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

载体介导的幽门螺杆菌NAP疫苗研制现状

李文桂,陈雅棠

重庆医科大学 附属第一医院传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

幽门螺杆菌感染可引起胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤及胃癌等疾病，采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。中性粒细胞激活蛋白（NAP）是一种有效的疫苗候选分子，我们简要综述了鼠伤寒沙门菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌和麻疹病毒等载体介导的幽门螺杆菌NAP疫苗的研制现状。

幽门螺杆菌；中性粒细胞激活蛋白（NAP）；疫苗

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染可引起胃炎、胃和十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤和胃癌等疾病，1994年世界卫生组织国际癌症研究机构已将Hp列为Ⅰ类致癌原。Hp治疗常采用氨苄青霉素和甲硝唑等抗生素、铋剂等胃黏膜保护剂，以及奥美拉唑等质子泵抑制剂的三联或四联疗法，但存在患者依从性差、费用高昂、再次感染、药物副作用或耐药等诸多问题，使得研制疫苗防治Hp感染成为当前研究的热点之一。

中性粒细胞激活蛋白（neutrophil-activating protein，NAP）是一种铁蛋白，其单体的相对分子质量为17 000，可聚集为150 000的十二聚体。NAP位于Hp菌体内，通过自溶释放后，与中性粒细胞和单核细胞的外膜相结合，促进中性粒细胞与胃上皮细胞黏附，然后通过G蛋白的作用使细胞内Ca2+升高，激活丝氨酸激酶和PL3-K激酶，然后激活中性粒细胞和单核细胞表面的NADPH酶，诱导活性氧产生，从而造成胃黏膜的炎性反应。LTK63是大肠埃希菌不耐热肠毒素（LT）经过基因突变用赖氨酸代替第63位色氨酸，是一种较好的免疫佐剂。Stain等[1]将NAP加LTK63口服免疫小鼠可对抗Hp攻击，保护力达80％（8/10）。高原等[2]将150μg重组LTB-NAP融合蛋白灌胃免疫BALB/c鼠，初次免疫后1、2和3周加强3次，末次免疫后1周发现免疫鼠的血清IgG和胃小肠液sIgA升高，这些资料表明NAP具有较好的免疫原性，是一种有希望的疫苗分子。

细菌和病毒等病原体通常对人体具有一定的致病性，应用化学或分子生物学技术突变它们的致病基因，可降低其毒性，但保留了它们对黏膜的侵袭力。将减毒病原体作为疫苗传递载体，就是利用它们穿透宿主细胞的能力，将疫苗抗原运载至抗原提呈细胞，促进机体的免疫应答。随后人们构建了鼠伤寒沙门菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌和麻疹病毒等病原体的减毒株，这些减毒株均可成为有希望的疫苗载体。我们拟就这些载体介导的幽门螺杆菌NAP疫苗的研制现状做简要综述。

1 重组鼠伤寒沙门菌疫苗

鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium，St）的减毒株主要用于伤寒和副伤寒的免疫预防。分子生物学技术的发展为将St减毒株发展成为多价疫苗载体打下了坚实的基础。随后人们构建了大量St减毒株，如伴腺苷酸环化酶（cya）、CAMP受体蛋白（crp）和天冬氨酸β半醛脱氢酶（asd）基因缺失的营养缺陷性突变株，以及伴芳香族氨基酸（aro）基因缺失的营养缺陷性突变株等，这些St减毒株均是2个或多个基因位点的精确突变，因而其基因型和表型均很稳定，可用作重组多价疫苗的表达载体[3-5]。焦志勇等[6]以幽门螺杆菌SS1株DNA为模板扩增450bp的NAP基因，插入pTrc99A得pTrc-NAP，将其转化LB5000进行甲基化修饰后，再电穿孔转化SL3261株，筛选培养，免疫印迹证实兔抗Hp血清识别重组菌表达的相对分子质量为15 000的NAP；将1×107CFU疫苗口服免疫BALB/c鼠，免疫后4周口服1×107CFU幽门螺杆菌SS1株进行攻击，攻击后4周发现免疫组的胃组织Hp负荷显著低于对照组。

孙波等[7]以幽门螺杆菌SS1株DNA为模板扩增435bp的NAP基因，插入pBT得pBT-NAP，与pIRES重组得pIRES-NAP，将其转化LB5000进行甲基化修饰后，再电穿孔转化SL7207，筛选培养，SDS-PAGE发现重组菌表达15 000的NAP；将1×109CFU的幽门螺杆菌SS1株口服感染BALB/c鼠，感染后30周用1×109CFU疫苗灌胃进行免疫治疗，治疗后1、2周加强2次，末次免疫后4周发现免疫鼠的血清IgG滴度为1∶32 768，免疫组的保护力可达75％（3/4）,而对照组的保护力为0（0/4）。

2 重组乳酸乳球菌疫苗

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，LL）是乳制品工业发酵的重要菌类，也是一种有希望的疫苗载体[8]。乳球菌的细胞壁厚且复杂，摄取外源DNA较为困难。Kim等[9]用电穿孔方法进行外源DNA转化乳酸杆菌的试验，摸索出了较好的转化条件，为构建重组乳球菌疫苗提供了便利。为了将外源DNA有效引入乳球菌，常需要构建诱导型大肠杆菌-乳球菌穿梭表达载体，它可利用诱导剂对外源蛋白进行可控性表达。Ruyter等[10]开发了乳菌肽控制的表达系统（nisin-controlled expres⁃sion system，NICE）。通常将含有nisA启动子的质粒导入携带nisR和nisK蛋白基因的宿主菌时，外源基因的表达较弱，当在对数生长期加入乳菌肽进行诱导后，外源基因的表达水平在一定范围内与乳菌肽的剂量成正比，诱导效率可以达到1000倍以上[11]。李建芳等[12]以幽门螺杆菌的26695株DNA为模板扩增435bp的NAP基因，插入pNICE-SEC得pNICE-NAP，将其电穿孔转化乳酸乳球菌NZ9000株，20ng/mL乳菌肽诱导6h，SDS-PAGE证实重组菌可表达17 000的NAP；免疫印迹表明兔抗Hp血清识别重组菌表达的NAP；将5×109CFU疫苗口服免疫ICR鼠，初次免疫后1、2、9、16、23和30d加强6次，末次免疫后2周发现免疫鼠的血清IgG和肠sIgA升高，滴度分别为1∶1000和1∶50，但未进行保护力的研究。

3 重组枯草芽孢杆菌疫苗

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）自身没有致病性，在极端条件下，可诱导产生抗逆性很强的内源孢子即芽孢。Cutting等[13]发现该菌的芽孢可分为核、皮层、内层和外层等结构；Chada等[14]发现芽孢外层的芽孢衣蛋白CotC、CotB及CotX具有一定的伸缩性，可延长或缩短，这对于芽孢的形成和萌发，以及芽孢表面呈现外源抗原具有重要作用。Tam等[15]认为该菌的芽孢能够在人体胃肠道内萌发和形成芽孢；Duc等[16]发现该菌的芽孢不仅可在其表面融合表达外源抗原，还可在芽孢萌发后，在繁殖体内表达外源抗原，提示该菌的芽孢是一种有希望的疫苗载体。Shih等[17]以Hp 26696株的基因组DNA扩增NAP编码基因，将其插入pCR4-TOPO得pCR4-NAP，与pET28α重组得pET28α-NAP，与 pRAP重组得 pRAP-NAP，电穿孔转化枯草芽孢杆菌DB104株，筛选重组菌，培养后经SDS-PAGE证实重组菌可表达17 000的Hp-NAP，免疫印迹表明抗Hp-NAP的鼠血清可识别Hp-NAP重组蛋白，生物学试验表明该重组蛋白可诱导人中性粒细胞产生反应氧等活性产物。

4 重组麻疹病毒疫苗

人们发现麻疹病毒的减毒株Schwarz是有效的疫苗载体，可有效表达多种外源抗原[18-20]。Iankov等[21-23]以麻疹病毒26695株的DNA为模板扩增 NAP基因，插入p（+）MVeGFP得p（+）MVNAP，与MV-lambda重组得MV-NAP，将其转化麻疹病毒减毒株Schwarz后，再转染非洲绿猴肾细胞Vero株，筛选培养96h，免疫印迹发现鼠抗NAP的单抗识别重组病毒表达的NAP；将1×106PFU重组病毒腹腔注射免疫IFN-rR-/-CD46-/-基因敲除鼠，发现免疫鼠的血清IgG在免疫后4～21d升高，21d达较高水平；免疫酶斑点试验证实在免疫后35d脾IFN-γ+分泌细胞的数目显著增加；随后将2×105PFU重组病毒接种IFN-rR-/-CD46-/-基因鼠，免疫后18、30和180d免疫鼠的血清IgG滴度分别为1∶102 400、1∶512 000和1∶409 600，免疫后4周免疫鼠的血清IgG1、IgG2a和IgG2b升高，IgG2a与IgG1比值大于1。最后将1×106的MBA231-lu-P4乳腺癌细胞株静脉注射无胸腺的裸鼠建立小鼠乳腺癌扩散模型，建模后6d静脉注射1×106PFU重组病毒进行免疫治疗，每天1次，连续10d，末次免疫治疗后9d发现治疗鼠的血清IL-6升高，胸液TNF-α、IL-6和IL-23升高，治疗鼠的生存时间显著高于未治疗鼠。

5 结语

尽管大部分现有载体介导的幽门螺杆菌NAP疫苗可诱导宿主产生一定的保护性免疫应答，但它们产生的保护力通常较低，远未达到人们所期望的水平。同时还发现，重组鼠伤寒沙门菌疫苗的表达产物与天然蛋白存在差异，表达水平较低；重组乳酸乳球菌疫苗易于培养，转化效率高，重复性好,但长期低剂量口服该疫苗有可能诱导免疫耐受[24]；重组枯草芽孢杆菌疫苗含有大量胞内和胞外的蛋白水解酶，使外源蛋白无法稳定存在，同时它还缺乏蛋白修饰系统，不能高效合成真核蛋白；重组麻疹病毒的安全性和有效性值得进一步关注。

随着分子生物学和分子免疫学等技术的发展，将会促进对幽门螺杆菌的基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学及表观遗传学等进行深入研究，从而阐明Hp的生物学特性及其致病机理，弄清幽门螺杆菌抗原的结构与功能的关系，寻找有效的疫苗分子，筛选合理的抗原组合，探索合适的载体系统和安全有效的疫苗佐剂，制订有效的免疫接种方案，寻找能客观反映人体免疫状况的动物模型，选择更为确切的免疫保护力评价指标，制订规范的疫苗评价体系。相信随着这些问题的阐明，必将推动载体介导的幽门螺杆菌NAP疫苗研究跃上一个新的台阶。

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Research Status of NAP Vaccine Against Helicobacter pylori Mediated by Vectors

LI Wen-Gui*,CHEN Ya-Tang
Institute of Infectious and Parasitic Diseases,the First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongq⁃ing 400016,China
*Corresponding author,E-mail:cqliwengui@163.com

Helicobacter pylori infection may cause dieaseses such as chronic gastritis,peptic ulcer,gastric muco⁃sa-associated lymphoid tissue lymphoma and gastric cancer,and using vaccine to control this bacterium has be⁃come a highlight recently.The neutrophil-activating protein（NAP） is one type of effective candidate molecules of vaccine,the review outlined the status in the research of NAP vaccine against H.pylori mediated by Salmonella ty⁃phimurium,Lactococcus lactis,Bacillus subtilis and Measles virus.

Helicobacter pylori;neutrophil-activating protein（NAP）;vaccine

R979.5;R392.1

A

1009-0002（2017）04-0564-04

2016-12-21

国家自然科学基金（30801052，30671835，30500423，30200239）

李文桂（1967-），男，博士，研究员

李文桂，（E-mail）cqliwengui@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.032