CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肿瘤模型中的应用进展

熊伟，杨勇琴，自加吉，孙美涛，梅雯，左绍远，张晓娟

1.大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000；3.大理市第一人民医院 呼吸内科，云南 大理 671000

CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肿瘤模型中的应用进展

熊伟1,2，杨勇琴1，自加吉1，孙美涛1，梅雯1，左绍远1，张晓娟3

1.大理大学 基础医学院，云南 大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000；3.大理市第一人民医院 呼吸内科，云南 大理 671000

CRISPR-Cas9是一种以细菌和古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的新型基因编辑技术。与传统的锌指核酸酶（ZFN）、胚胎干细胞（ES细胞）打靶和转录激活因子样效应因子核酸酶（TALEN）技术相比，该基因编辑技术具有操作简单、更加高效、更容易获得纯合子突变体、细胞毒性小、无物种限制等优势，但也存在脱靶效应等缺点。目前，CRISPR-Cas9技术已被广泛用于肿瘤相关研究中，尤其在构建实验动物肿瘤模型中取得许多重要成果。我们主要对CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肝癌模型、结直肠癌模型、肺癌模型、宫颈癌模型、白血病模型、脑瘤模型中的研究现状及应用进展做简要综述。

CRISPR-Cas9；基因编辑；肿瘤；应用进展

CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nucle⁃ase 9）是古细菌和细菌在长期进化过程中形成的一种适应性免疫防御，用来保护自身基因组免受病毒、噬菌体及其他外源核酸的破坏和干扰[1]。每个CRISPR含有多个长24～48bp的重复序列，而这些重复序列被长度为26～72bp的间隔序列（spacer DNA）分隔开。CRISPR-Cas9系统将入侵噬菌体及质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性[2]。目前，由Ⅱ型CRISPR改造而来的CRISPR-Cas9系统在研究中被广泛使用，并已发展成为一种可用于基因组编辑的分子生物学利器[3-4]。CRISPR-Cas9技术已被广泛用于肿瘤的相关研究，尤其在构建实验动物肿瘤模型中取得许多重要成果。

实验动物肿瘤模型的建立，为揭示肿瘤发生发展过程的分子机制及探索肿瘤的治疗方法奠定了基础。实验动物模型是可以将基础和临床肿瘤研究有效整合和建立密切联系的理想载体，已被广泛用于肿瘤研究的多个领域。目前，建立实验动物肿瘤模型的方法基本可分为4类：移植型实验动物肿瘤模型、自发和诱发实验动物肿瘤模型、基因敲除实验动物肿瘤模型、转基因实验动物肿瘤模型[5]。其中，基因敲除动物肿瘤模型是指利用基因敲除方法去除抑制肿瘤发生相关的基因，从而诱导动物肿瘤发生的动物模型[6]。这对于认识单一基因或数个基因在肿瘤发生中的作用是一种理想的模型。随着基因编辑技术的开发和进步，也同样促进了用于研究人类恶性肿瘤特点的实验动物肿瘤模型的开发。因此，科学家们迫切需要一种高效且快速的基因编辑技术，可以精确地控制细胞内基因的表达水平。相对于传统的基因编辑技术，如锌指核酸内切酶（zinc-finger nucleases，ZFN）[7]、胚胎干细胞（em⁃bryonic stem cells，ES细胞）打靶[8]和转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术[9]，CRISPR-Cas9技术更好地满足了科学家们在此方面的需求。由于CRISPR-Cas9系统没有物种限制，已成功地在小鼠、大鼠、食蟹猴、家猪、线虫、斑马鱼等多种实验动物中实现了精准的基因编辑[10-17]。我们对近年来CRISPR-Cas9基因编辑技术在构建实验动物肿瘤模型中的研究现状及应用进展做简要综述。

1 CRISPR-Cas9基因编辑技术的工作原理

CRISPR-Cas9基因编辑系统由有核酸内切酶活性的Cas9蛋白和单链的singleguideRNA（sgRNA）组成。CRISPR-derived RNA（crRNA）通过碱基配对与trans-activating RNA（tracrRNA）结合形成crRNA/tracrRNA复合物，此复合物引导Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这2种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA，足以引导Cas9蛋白对DNA的定点切割[18]。当Cas9酶剪切基因组DNA 时，可以在 protospacer-adjacent motif（PAM）序列前产生一个双链切口（double-strand break⁃ers，DSBs），由于细胞基因组具有自我修复功能，通过非同源末端连接（nonhomologous end-joining，NHEJ）方式可以使基因组发生随机的插入-删除（insertion and deletion，INDEL）效应[19]。当细胞内有基因组同源臂序列存在时，基因组会进行同源修复（homology-directed repair，HDR），从而实现对基因组任意位点的序列编辑[20]。

作为一种RNA导向的双链DNA（dsDNA）结合蛋白，Cas9效应物核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白，因此拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。对动物体细胞或受精卵导入Cas9蛋白的mRNA，以及靶向特定序列的sgRNA，即可实现动物体内基因的失活或缺陷基因的修复[21]。Cas9蛋白能在任何dsDNA序列处带来融合蛋白及RNA，这为生物体的改造和研究带来巨大潜力。

2 CRISPR-Cas9技术构建实验动物肿瘤模型的应用进展

相较于传统的实验动物肿瘤模型构建模式，CRISPR-Cas9技术在构建动物模型上的应用主要有2条途径：①应用CRISPR-Cas9技术编辑细胞内的一个或多个基因，之后应用基因编辑后的肿瘤细胞建立移植型实验动物肿瘤模型，分析肿瘤表型与基因之间的关系；②动物尾静脉注射CRISPR-Cas9系统或者在动物组织注射病毒包裹的CRISPR-Cas9系统，实现动物体细胞或组织特异性的基因编辑，从而建立实验动物肿瘤模型[22]。

2.1 构建实验动物肝癌模型

利用小鼠模型对肿瘤相关基因的研究，传统的ZFN和TELEN技术是在受精卵水平上进行基因编辑，然后将编辑后的受精卵培养为成鼠[23]。2014年，美国麻省理工学院Jacks教授领导的团队首次报道了利用CRISPR-Cas9技术在小鼠肝细胞直接引入肿瘤基因突变来诱导肿瘤形成并构建肝癌小鼠模型的新方法[24]。该团队通过尾静脉高压注射技术，将表达Cas9和sgRNAs的CRISPR质粒导入小鼠肝脏，它们结合后可以靶向肿瘤抑制基因Pten和p53（又称TP53和Trp53）。CRISPR介导的Pten突变致使小鼠肝细胞内Akt的磷酸化水平提高，以及过多的脂质在肝细胞内囤积，这与使用Cre-LoxP基因敲除技术构建的小鼠肝癌模型的表型相同。同时靶向Pten和p53，诱发了肝脏肿瘤，也与通过Cre-LoxP介导的Pten和p53双基因敲除的效果一致。小鼠肝脏和肿瘤组织的DNA测序结果表明，肿瘤细胞内存在抑癌基因Pten和p53的双等位基因插入或缺失突变。此外，研究者们利用CRISPR系统，在尾静脉注射靶向β-catenin基因的sgRNA，同时还注射了带有同源臂的模板序列，在小鼠肝组织中将重要的肿瘤相关基因β-catenin实现了点突变，进而导致肝细胞内发生点突变后的β-catenin蛋白发生核移位的，最终导致小鼠肝脏的癌变。这项研究阐述了用CRISPR/Cas系统直接突变抑癌基因和原癌基因的可行性，提供了一种实验动物肝癌模型构建的新方法，也为功能基因组学研究提供了新的途径。通过这项实验，科研人员首次利用CRISPRCas9技术在成年小鼠肝脏内进行抑癌基因和原癌基因的编辑。CRISPR-Cas9技术避开了传统基因编辑技术在胚胎干细胞上进行的编辑，以及饲养杂合体小鼠的繁琐过程，能够大大降低实验成本，节省实验时间，提高实验效率。

2.2 构建实验动物结直肠癌模型

结直肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，在西方国家和我国均有很高的发病率。在结直肠癌患者的肿瘤样本中，TP53、MAPK、TGF-β及PI3K通路的基因有多发性基因突变现象，但这些基因在肿瘤发生发展过程中的具体作用仍不十分明确[25]。Matano等将多基因编辑建立实验动物肿瘤模型的理念应用到肠癌研究中，建立了源自正常肠道上皮的结直肠癌类器官[26]。应用CRIS⁃PR-Cas9技术对抑癌基因 TP53、APC、SMAD4，以及癌基因PIK3CA和KRAS进行基因突变，发现表达全部5种基因突变的结直肠癌类器官都出现了明显的肿瘤样变化，在体外不依赖于干细胞巢的因子就能快速生长，进一步在裸鼠肾包膜下移植癌细胞会形成肿瘤。研究表明，激活通路突变即可在肿瘤微环境中维持肿瘤干细胞特性，但肠癌细胞的侵袭性行为还需要细胞内有更多的分子出现损伤。这项研究揭示了多基因突变对肿瘤发生的协同作用，是一种新的肿瘤研究思路。

2.3 构建实验动物肺癌模型

CRISPR-Cas9是一项多功能的用于研究遗传元件功能的基因组编辑技术。为使Cas9在体内得到更加广泛的应用，张峰团队构建了一种Cas9蛋白条件性表达的小鼠模型，有效克服了向成鼠体内导入Cas9的困难，简化了体内进行基因编辑的步骤，提高了编辑效率[27]。随后，分别在体内及体外进行基因组编辑，利用腺相关病毒（AAV）、慢病毒及纳米颗粒介导的形式在神经元、免疫细胞、内皮细胞中导入sgRNA。利用这些Cas9小鼠，他们选择了肺腺癌中3个突变最显著的基因KRAS、p53和LKB1，用AAV载体向Cas9小鼠中导入p53和LKB1基因的sgDNA，通过同源重组介导的修复引入KRASG12D基因突变，基因突变后的小鼠肺组织中出现了明显的肿瘤结节，且随着时间的延长瘤体显著增大，应用全新的方法成功构建了小鼠的肺癌模型。该研究建立的小鼠肿瘤模型与传统的遗传改变小鼠肿瘤模型相比，不仅实现了特定组织的多基因敲除，而且是多基因共同作用对肺癌表型影响的模型，可以更加准确地反应肿瘤发生的分子机制和肿瘤的表型。同时，这一研究成果证实了Cas9条件性表达小鼠在基因组编辑和癌症建模中可以广泛应用。目前，Cas9小鼠模型已被该科研团队提供给全世界多家实验室，人们正在利用该小鼠模型进行基因组学的研究。

在非小细胞肺癌中，肿瘤细胞的2号染色体发生断裂，基因易位会导致EML4与ALK基因发生基因融合。EML4-ALK融合基因在细胞恶性转化过程中具有潜在的致癌作用，是染色体重排发生基因融合对肿瘤发生发挥重要作用的经典例子[28]。Maddalo等用CRISPR技术在肿瘤细胞中表达EML4-ALK融合基因，建立了具有ALK+人类非小细胞肺癌典型的分子特征和病理特征的实验动物模型[29]。与基因打靶技术构建的实验动物肿瘤模型相比，这项实验技术成本更低，速度更快。

此外，Sanchez-Rivera等在肺癌的研究中也采用了多基因编辑技术，他们把表达CRISPR系统的慢病毒注入小鼠肺组织，构建条件性表达Kras癌基因的小鼠肺癌模型；采用CRISPR技术靶向不同基因（Pten，Nkx2-1），通过表型分析研究每个基因与Kras癌基因的协同对肿瘤发生的影响[30]。

2.4 构建实验动物宫颈癌模型

宫颈癌又称宫颈浸润癌，是最常见的妇科恶性肿瘤，高危性人乳头瘤病毒（HPV）癌基因（E6和E7）表达异常是宫颈癌发病的重要原因[31]。Zhen等基于CRISPR-Cas9技术建立了靶向编辑E6、E7基因的编辑系统，并将该系统转染HPV-16阳性的宫颈癌SiHa细胞株。结果表明，利用CRISPR-Cas9系统进行E6、E7基因及其启动子的编辑后，会导致p21和p53蛋白在宫颈癌细胞内的积累，从而显著降低细胞在体外的增殖能力。随后，研究人员通过裸鼠皮下接种肿瘤细胞的实验，构建了皮下宫颈癌移植瘤的动物模型。研究发现，经CRISPR-Cas9技术靶向编辑E6、E7基因后的肿瘤细胞接种的小鼠体内，肿瘤的生长受到明显抑制[32]。这为CRISPR-Cas9技术在靶向编辑高危性HPV致癌基因的基因治疗中的应用提供了实验依据。

2.5 构建实验动物白血病模型

白血病，也称为血癌，是一种造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。染色体易位在白血病患者体内较为常见，在研究白血病发病的初始机制时，需要一种有效的方法以精确重现这种肿瘤相关的染色体易位。急性粒细胞性白血病中ETO和RUNX1基因融合的现象比较常见，Torres等利用sgRNA介导的CRISPR-Cas9系统构建了这种肿瘤相关的染色体易位，在人类细胞系和原代细胞中模拟出与急性骨髓性白血病高度一致的染色体重排模型，这些研究展示了CRISPR-Cas9技术的精确度和可靠性，为染色体易位相关肿瘤的研究提供了有力工具[33]。再如，获得性和先天性的7号染色体长臂缺失，常见于症急性粒细胞白血病和骨髓异常增生综合征，而且往往预示与预后不良相关[34]，但是对定位于人类7号染色体长臂上的相关抑癌基因的功能研究目前尚不明确。组蛋白H3K4三甲基化转移酶（MLL3）由7号染色体上的一个抑癌基因编码，属于MLL蛋白家族，可以甲基化H3K4位置的赖氨酸，从而调控下游相关基因的转录水平[35]。目前，已经发现该基因在白血病、乳腺癌、结肠癌、髓母细胞瘤等细胞中广泛存在及表达[36-37]。Chen等利用CRISPR-Cas9技术对MLL3基因进行编辑，并获得了该基因表达水平下调至野生型50％水平的小鼠模型[38]。在此基础上，配合其他因7号染色体长臂缺失导致的事件，最终促进白血病的发生。通过这种方法构建的小鼠白血病模型证实了MLL3基因是7号染色体长臂上的一个单倍剂量不足的抑癌基因，并且为白血病的基因治疗提供了新的策略。

对肿瘤基因组测序的结果提示，在人类恶性肿瘤的发生发展过程中，往往存在4个甚至更多基因的突变，但是利用传统的实验动物模型育种方法很难模拟出这种基因突变的复杂性。2014年，美国哈佛医学院的Heckl等报道，利用CRIS⁃PR-Cas9基因编辑技术克服了这一限制[39]。他们将sgRNA和Cas9共同导入同一只小鼠的造血干细胞，对其中多个基因（Tet2、Runx1、Dnmt3a、Nf1）同时进行基因编辑，发生基因突变的细胞出现了明显的恶性髓系血液病的表型变化。因此而获得的急性粒细胞白血病模型小鼠能够与白血病患者中出现的转录因子、信号通路相关的细胞因子等基因突变相匹配。这项研究结果显示，利用慢病毒转导sgRNA和Cas9的系统进行编辑，能够用于体内多基因突变肿瘤模型的构建，从而更好地模拟人类肿瘤的复杂性。

2.6 构建实验动物脑瘤模型

传统的脑瘤动物模型具有多种缺陷。例如，基于细胞系建立的异源移植肿瘤（CDX）模型的细胞主要是高等级来源，并且这种模型不能全面地模拟脑瘤的不同等级。传统的遗传工程小鼠模型（GEMM），其生成是一个低效和耗时的过程。CRISPR-Cas9系统作为一种新的工具，可以克服现有方法的不足[40]。它能够准确有效地在一个选择的DNA位点获得靶基因组的遗传突变。在中枢神经系统中，已成功地利用CRISPR基因敲除技术构建了髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤的动物模型[41-42]，也确定了与脑瘤病因密切相关的一些调节因子（p53、Nf1、Pten、Ptch1、Bmi1、Met、Notch1、CDK6、miR-10b、TERT、LSD1、miR-218 、miR-128）[43]。研究发现，多个肿瘤相关基因（包括p53、Nf1、Pten和 Ptch1）通过 CRISPR-Cas9技术造成缺失，可诱导脑瘤的形成[44]。这些研究均提示，可以利用CRISPR-Cas9系统，操纵与脑瘤生成相关的其他调节因子，快速有效地构建基于遗传改变的脑瘤模型，为研究脑瘤发生与基因突变之间的关系提供了有力工具。

3 结语

恶性肿瘤一直是威胁人类健康和生命的重大疾病，也是当前生命科学和医学研究的热点。肿瘤的发生和发展涉及多条信号通路，是一个多基因共同参与且缓慢持续的过程[45]。构建实验动物肿瘤模型是肿瘤研究中常用的方法[46]。研究肿瘤相关基因的功能，需要在细胞不同的分化阶段，或在动物体内外对不同的基因进行有效干扰或敲除，并以此为基础研究肿瘤发生发展过程与基因的关系[47]。相较于传统的转基因技术和基因敲除技术，CRISPR-Cas9技术具有设计简单和操作方便的优点，科学家们将CRISPR系统创造性地应用于恶性肿瘤的研究，构建了许多实验动物肿瘤模型。CRISPR系统作为一种快速且有效的基因编辑工具，已被用于细菌、植物、无脊椎动物、哺乳动物和人类细胞，几乎没有物种限制[48]。值得一提的是，河北科技大学的韩春雨团队最近报道，他们开发出了一种基于NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具，为哺乳动物基因组编辑提供了另一种手段[49]。相较于已经较为成熟的CRIS⁃PR技术，NgAgo技术尚处于起步阶段，其应用价值有待于后续科学研究的摸索和验证。

目前，CRISPR-Cas9基因编辑技术正势如破竹地攻克着肿瘤研究领域的一个个难题，不仅丰富了肿瘤研究的技术手段，而且提供了肿瘤研究的新视角和新思路。可以预见的是，CRISPRCas9技术将快速融入肿瘤细胞分子生物学研究中，可以帮助科学家们精准且快速地进行动物体基因组的编辑，构建基因突变和基因敲除的实验动物肿瘤模型，为肿瘤相关基因的全面研究以及肿瘤的基因治疗奠定基础[50]。

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Application Progress of CRISPR-Cas9 Gene Editing Tech⁃nology in Constructing Experimental Animal Tumor Models

XIONG Wei1,2*,YANG Yong-Qin1,ZI Jia-Ji1,SUN Mei-Tao1,MEI Wen1,ZUO Shao-Yuan1,ZHANG Xiao-Juan3
1.College of Basic Medical Sciences,Dali University,Dali 671000;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Ento⁃mological Biopharmaceutical R&D,Dali 671000;3.Dali First People's Hospital,Dali 671000;China
*Corresponding author,E-mail:xwailp@163.com

The CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nucle⁃ase 9） genome editing technology is a new type of gene editing technology based on the immune mechanism of ar⁃chaea resisting the invasion of exogenous nucleic acid.Compared with zinc-finger nucleases（ZFN）,gene targeting in embryonic stem（ES） cells and transcription activator-like effector nucleases（TALEN） technology,CRISPR-Cas9 system is more efficient,simply to operate,and less cytotoxic.Moreover,it has been widely used in genome edit⁃ing in multiple species and related tumor research,including research on constructing experimental animal tumor models.In this paper,we are aimed to summarize the research status and application progress of the the CRISPRCas9 system in constructing experimental animal tumor models.

CRISPR-Cas9;gene editing;tumor;application progress

Q78;R730

A

1009-0002（2017）04-0551-07

2016-11-10

国家自然科学基金（81560458，31601155）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（2014Z126）；大理大学博士科研启动基金（BSKY2012018）；大理大学大学生创新创业计划（X-CXCY-2016-13）

熊伟（1982-），男，副教授，博士，硕士生导师

熊伟，（E-mail）xwailp@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.030