叶绿体生物制药的研究进展

程明林

(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266000)

生物制药在治疗人类疾病方面起着重要的作用。然而，它们生产成本高，需要高纯度和低温储存，同时又受到短时间保质期的限制。通过开发具有低成本效益的大规模生产重组蛋白的表达平台可以解决这些问题[1]。转基因植物生产的药用蛋白质在很大程度上被生物技术工业所抛弃，主要是由于其产量低和最终产品的结构异质性所导致[2]。相比之下，转基因表达具有将转基因精确整合到叶绿体基因组内位点的能力，具有更高的产量和更稳定的基因表达水平等优点，在可食用植物细胞的叶绿体中生产治疗蛋白质取得了显着进展[3]。

1 叶绿体中的转录修饰(PTM)机制

PTM在维持治疗性蛋白质的稳定性和生物活性方面起着重要作用[4]。虽然植物细胞质和分泌途径中的PTM途径已被大量阐明，但是叶绿体中蛋白质修饰的机制仍然知之甚少。可逆磷酸化几乎在细胞过程的每个环节都严格调节蛋白质功能的活性。因此，异常磷酸化是许多疾病的主要原因之一，包括癌症、神经变性和慢性炎症[5]。研究表明，凝血因子磷酸化会增强激活蛋白C(APC)失活的敏感性，从而降低凝血效率[6]。同样，组织因子的高磷酸化阻止了它与其他止血蛋白的相互作用，并干扰凝血酶的形成[7]。通过定位叶绿体的磷酸蛋白和执行磷酸化功能的激酶来证明植物叶绿体中磷酸化活性的存在。植物叶绿体中复杂的氧化还原调节机制表明叶绿体系统中多聚体蛋白的组装与二硫键的形成有关[8]。二硫键的形成对稳定三级结构和促进多种重组治疗蛋白的功能起着重要的作用。在植物叶绿体中生产药物蛋白质以治疗糖尿病和传染病等疾病，表明了叶绿体中存在着内源性蛋白二硫转移酶，以确保适蛋白质的完整。在叶绿体中表达的RC101(逆转录酶)被认为是二硫键的环化。此外，叶绿体衍生的CTB融合蛋白与GM1受体的有效结合需要通过二硫键形成五聚体结构。除了内源性酶外，外源蛋白二硫键异构酶和硫氧还蛋白的共同表达使人血清蛋白在叶绿体中蛋白质折叠效率提高[9]。

2 植物叶绿体中重组蛋白的功能

2.1 预防和治疗传染病

将各种从细菌，病毒，真菌或原生动物的疫苗抗原克隆到叶绿体表达载体中，并通过基因枪轰击将其转化成叶绿体基因组[3]。一旦实现了同源，重组蛋白的高水平表达占总蛋白的70%[10]。已经在植物叶绿体中表达了几种亚单位疫苗候选物，针对各种感染性病原体[7]。针对全球传染病产生的PMB包括几种结核分枝杆菌疫苗抗原，炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)和脊髓灰质炎(脊髓灰质炎VP1)疫苗抗原，表达水平占全部可溶性蛋白质的4%至18%。除亚单位疫苗抗原外，抗原肽(AMP)也已在叶绿体中表达[11]。AMPs是在一类不断增长的低分子量寡肽，广泛的抗菌活性，对病毒、真菌和细菌有广泛的抗菌作用。与抗生素不同，AMPs针对微生物细胞膜中的脂多糖，并诱导快速杀死病原体。除抗菌作用外，AMPs已被证明具有免疫调节和伤口愈合的特性[12]。

2.2 治疗代谢紊乱

在糖尿病治疗中蛋白质治疗有着最高的需求。利用转基因技术在植物质粒中完成胰岛素的表达水平占总可溶性蛋白的50%。转基因植物的大规模生产使植物胰岛素剂量每年增加2000万。在植物叶绿体中，叶绿体表达的CTB-胰岛素原融合蛋白有效组装可在动物模型中具有完全功能。利用胰高血糖素样肽-1(GLP-1)刺激胰腺分泌胰岛素来治疗II型糖尿病。由于GLP-1在血清中的半衰期非常短，治疗II型糖尿病集中在二肽基肽酶IV(DPP-IV)类似物(如：毒蜥外泌肽-4(EX4))，其具较长的血清半衰期(≥4h)。小鼠口服给药植物衍生的EX4融合人转运蛋白(转铁蛋白)，通过刺激胰岛素的分泌来降低葡萄糖，并促进胰腺b细胞的分化和增殖[13]。此外，叶绿体表达的CTB-EX4在口服给药时表现出刺激胰岛素的作用，而不引起低血糖的副作用[14]。CTB-EX4融合蛋白在转基因植物中有非常高的产量并且成本效益低，使其成为治疗II型糖尿病最理想的口服生物药物。

2.3 免疫调节

血友病是由凝血因子X连锁突变引起的一种出血性疾病。目前，终身输注凝血因子VIII(FVIII，治疗血友病A)或因子IX(FIX，治疗血友病B)是血友病患者的治疗标准。血友病治疗的主要问题是连续输入蛋白质后会抑制抗体的发展。这种对蛋白质抗原的免疫引起的过敏反应，在严重的情况下是致命的[15]。目前免疫耐受诱导(ITI)的临床方案需要长期施用高剂量的凝血因子。然而，这种临床方案非常昂贵，并不能保证有效的免疫耐受。在蛋白质替代治疗期间，通过口服给药植物细胞表达的FIX可诱导免疫耐受性[16]。通过口服给药在叶绿体中表达全长FIX结构域或冻干转基因植物细胞凝血因子VIII可成功地消除了小鼠体内抑制剂的形成[17]。除血友病外，口服给药在植物叶绿体中表达的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)抗原决定簇可让小鼠消除了庞贝氏症的抗体反应[18]。因此，使用在叶绿体中表达抗原的免疫调节是可行的。

3 结语

在植物叶绿体中生产功能性药物蛋白质通过口服给药用以治疗糖尿病、血液疾病、代谢紊乱和传染病以及免疫调节是可行的，并且解决了生物制药生产成本高昂和难储存的问题。然而功能性蛋白质的开发仍面临挑战。例如，来源细菌的原核基因的高水平表达是可行的，但大型基因(人类或病毒)的表达仍未解决。因此，必须在可食用作物中开发无标记的转基因植物，以推进叶绿体生物药物临床应用。更重要的是，需要进一步的研究来了解在植物叶绿体中表达的外源蛋白质的翻译后修饰。这应有助于进一步推进在植物细胞中制备口服给药的生物药物。

参考文献

[1]Kwon K C,Daniell H.Low-cost oral delivery of protein drugs bioencapsulated in plant cells[J].Plant Biotechnol J,2015,13(8):1017-1022.

[2]Sabalza M,Christou P,Capell T.Recombinant plant-derived pharmaceutical proteins: current technical and economic bottlenecks[J].Biotechnol Lett,2014,36(12):2367-2379.

[3]Daniell H,Chan H T,Pasoreck E K.Vaccination via chloroplast genetics: affordable protein drugs for the prevention and treatment of inherited or infectious human diseases[J].Annu Rev Genet,2016,50:595-618.

[4]Xu J,Dolan M C,Medrano G,et al.Green factory: plants as bioproduction platforms for recombinant proteins[J]. Biotechnol Adv,2012,30(5):1171-1184.

[5]Cohen P.The role of protein phosphorylation in human health and disease[J].Eur J Biochem,2001,268(10):5001-5010.

[6]Kalafatis M. Identification and partial characterization of factor Va heavy chain kinase from human platelets[J]. J Biol Chem,1998,273(14):8459-8466.

[7]Mori Y,Hamuro T,Nakashima T,et al.Biochemical characterization of plasma-derived tissue factor pathway inhibitor: post-translational modification of free,full-length form with particular reference to the sugar chain[J].J Thromb Haemost,2009,7(1):111-120.

[8]Wittenberg G,Danon A.Disulfide bond formation in chloroplasts: formation of disulfide bonds in signaling chloroplast proteins[J]. Plant Sci,2008,175(4):459-466.

[9]Sanz Barrio R,Millan A F S,Corral Martinez P,et al.Tobacco plastidial thioredoxins as modulators of recombinant protein production in transgenic chloroplasts[J].Plant Biotechnol J,2011,9:639-650.

[10]Boyhan D,Daniell H.Low-cost production of proinsulin in tobacco and lettuce chloroplasts for injectable or oral delivery of functional insulin and C-peptide[J].Plant Biotechnol J,2011,9(5):585-598.

[11]Holaskova E,Galuszka P,Frebort I,et al. Antimicrobial peptide production and plant-based expression systems for medical and agricultural biotechnology[J]. Biotechnol Adv,2015,33(6):1005-1023.

[12]Gupta K,Kotian A,Subramanian H,et al.Activation of human mast cells by retrocyclin and protegrin highlight their immunomodulatory and antimicrobial properties[J].Oncotarget,2015,6(30):28573-28587.

[13]Choi J,Diao H,Feng Z C,et al.A fusion protein derived from plants holds promising potential as a new oral therapy for type 2 diabetes[J].Plant Biotechnol J,2014,12(4):425-435.

[14]Kwon K C,Nityanandam R,New J S,et al.Oral delivery of bioencapsulated exendin-4 expressed in chloroplasts lowers blood glucose level in mice and stimulates insulin secretion in beta-TC6 cells[J].Plant Biotechnol J,2013,11(1):77-86.

[15]DiMichele D M.Immune tolerance in haemophilia: the long journey to the fork in the road[J].Br J Haematol,2012,159(2):123-134.

[16]Verma D,Moghimi B,LoDuca P A,et al.Oral delivery of bioencapsulated coagulation factor IX prevents inhibitor formation and fatal anaphylaxis in hemophilia B mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(15):7101-7106.

[17]Sherman A,Su J,Lin S,et al.Suppression of inhibitor formation against FVIII in a murine model of hemophilia A by oral delivery of antigens bioencapsulated in plant cells[J].Blood,2014,124(10):1659-1668.

[18]Herzog R W,Nichols T C,Su J,et al.Oral tolerance induction in hemophilia B dogs fed with transplastomic lettuce[J]. Mol Ther,2016,25(2):512-522.