丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8表达和心脏病理影响＊

李中南，程丽华，马超，窦德梅，邢宇婷，邢艳阳

（安徽中医药大学第一附属医院合肥230031）

丹蛭降糖胶囊对糖尿病大鼠心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8表达和心脏病理影响＊

李中南＊＊，程丽华，马超，窦德梅，邢宇婷，邢艳阳

（安徽中医药大学第一附属医院合肥230031）

目的：本文主要探讨丹蛭降糖胶囊（Dan Zhi Jiang Tang Capsule，DJC）对糖尿病大鼠心肌组织Toll样受体4（Toll-Like Receptor 4，TLR4）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factorα，TNFα）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）的干预及对心脏病理的影响。方法：取50只雄性大鼠，除正常组8只外，其余组给予高脂饲料喂养4周，按35mg·kg-1给大鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）1次，建立糖尿病大鼠模型。造模成功后将大鼠随机分为模型组、DJC高剂量组、DJC低剂量组、吡格列酮组。DIC高、低剂量组每日分别给予1.08、0.54 g·kg-1灌胃，吡咯列酮组予10mg·kg-1灌胃，模型组、正常组予以等量生理盐水灌胃，连续8周，并继续喂高脂饲料；测定血糖、HbA1c、血脂；观察心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8蛋白表达。结果：与正常组相比，模型组大鼠心肌组织TLR4、TNFα、IL-8表达增加（P＜0.01）；与模型组相比，DJC高、低剂量组大鼠心肌组织TLR4、TNFα、IL-8表达减少（P＜0.05或P＜0.01）。病理染色发现模型组大鼠心肌组织严重受损，DJC高剂量组大鼠心肌组织损伤程度明显减轻，且优于低剂量组和吡格列酮组。与正常组相比，模型组大鼠血糖、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平明显升高（P＜0.05或P＜0.01），与模型组相比，DJC高、低剂量组大鼠血糖、HbA1c、TG、TC、LDL-C水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。结论：丹蛭降糖胶囊能够明显下调TLR4、TNF-α、IL-8高表达水平，减轻糖尿病大鼠心肌病变程度；具有良好的降糖调脂作用。

丹蛭降糖胶囊心脏病理Toll样受体4肿瘤坏死因子α白介素-8

近年来，炎症和免疫学说日益受到人们的关注。TLR4是介导炎症和免疫反应的主体，可识别多种外源性配体，同时也能识别与炎症、应激、机体损伤等相关的内源性配体，从而导致一系列炎症和免疫反应的发生。TLR4信号传导通路对炎症和免疫反应相关基因表达有重要的调控作用，糖尿病动脉粥样硬化、冠心病、心肌病等疾病所引起的非细菌性炎性反应都与TLR4相关[1,2]。近年的研究表明，糖尿病心血管病发病率较高，而TLR4的高表达，可能起到加速糖尿病心肌病变的作用。高血糖可通过多种途径激活机体炎症反应，如：TNF-α、IL-8的高表达，而日益受到关注。本研究通过测定糖尿病大鼠心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8蛋白含量和心脏病理检测，探讨丹蛭降糖方对糖尿病大鼠心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8的影响，从而明确该方的作用机理，为防治糖尿病心肌病变的发生、发展找到新的治疗途径。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级、雄性健康SD大鼠50只，体质量200±20 g，购自安徽医科大学动物实验中心，许可证号scxk（皖）2013。大鼠一般状态良好，毛发茂盛有光泽，进食及活动正常，反应灵敏。

1.2 主要药物与试剂

DJC由太子参、丹皮、生地黄、菟丝子、泽泻、水蛭组方而成（安徽中医药大学第一附属医院药物制剂中心，规格：0.4 g/粒，批号：20130890）；盐酸吡格列酮（杭州中美华东制药有限公司，规格：15mg/片，批号：2015.0206）；STZ（美国Sigma公司，批号：s0130），RIPA细胞裂解液（强）（南通碧云天生物技术研究所），PVDF膜（美国Millipore公司，批号：K5CA1685L），ECL超敏发光试剂盒（美国Thermo公司，批号：QE218149），βactin一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：16AV0210），TLR4一抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号：160306），TNF-α试剂盒（上海源叶生物技术有限公司，批号：130529R），IL-8试剂盒（上海源叶生物技术有限公司，批号：132405R），水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司，批号：2010052501）。

1.3 主要仪器

血糖监测仪（美国强生公司，型号：稳豪型），特定蛋白仪（西门子公司），电泳仪（上海天能科技有限公司，型号：EPS300），转膜仪（上海天能科技有限公司，型号：VE-186），低速迷你离心机（海门其林贝尔仪器制造有限公司，型号：LX300），高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，型号：JW-3021HR），X胶片（美国伊士曼柯达公司），万分之一电子天平、微量移液器（德国艾本德股份公司），全自动生化仪（日本株式会社，型号：日立7600）。

1.4 动物分组造模与给药

取雄性SD大鼠50只，适应性喂养1周后，按数字表法随机选出9只作为正常对照组，予以基础饲料喂养（蛋白质16%、脂肪8%、碳水化合物50%）。其余作为实验组，给予高脂饲料进食（蛋白质15%、脂肪20%、碳水化合物50%，胆固醇5%，猪油10%）。高脂饲料喂养4周后，禁食8 h，一次性腹腔注射STZ 35mg·kg-1（临用前以pH 4.4的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制），120 h后尾静脉测血糖，以血糖≥16.7mmol·L-1为糖尿病大鼠造模成功[3]。造模成功后，将成模的糖尿病大鼠随机分为模型组、吡格列酮组、DJC高剂量组、DJC低剂量组，每组8只。各药物组继续予高脂饲料喂养，按人与大鼠单位体质量折算系数并计算药物量。吡格列酮组大鼠每日给药量为10mg·kg-1，DJC高剂量组每日给药量为1.08 g·kg-1，DJC低剂量组为0.54g·kg-1，正常对照组和模型组予以生理盐水5mL·kg-1；每日新鲜配置药液，灌胃1次，连续8周，每4周末行尾静脉采血测随机血糖。期间未成模动物2只，血糖过高死亡2只，动物打斗死亡1只。

1.5 观察指标与方法

大鼠连续给药8周后，禁食8 h后，以3%水合氯醛按10mg·kg-1腹腔注射麻醉，立即取血，测定血糖、血脂、HbA1c。迅速开腹，取出心脏，一部分放置于已备好的10%中性福尔马林中固定，备测做大鼠心脏病理；另一部分放置于-80℃冰箱中保存，备测心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8的蛋白表达，测定蛋白表达量。

1.6 Western Blot法检测心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8的表达

①蛋白的提取：采用碧云天RIPA细胞裂解液（含有1mM PMSF）提取匀浆后心肌组织中的蛋白；②蛋白质变性：将5×SDSBuffer加入到提取好的蛋白，煮沸变性；③SDS-PAGE凝胶电泳：凝胶由5%浓缩胶和10%分离胶配制而成，凝胶电泳参数：300mA、70min；④恒流转膜参数为：300mA转膜1 h；⑤封闭：5%脱脂奶粉37℃封闭2 h；⑥将封闭后的PVDF膜浸没在一抗孵育液中，4℃孵育过夜，再将一抗孵育液漂洗干净；⑦将漂洗后的PVDF膜浸没在二抗孵育液中，37℃孵育1 h，再漂洗干净；⑧在洗净二抗孵育液的PVDF膜上滴加ECL显影液，置于成像仪中显影并摄片，观察蛋白条带。

1.7 心肌组织病理检测

大鼠心脏经10%中性福尔马林固定48 h后，进行常规冲洗，上行乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，连续切厚片（5μm）；再将切片进行常规二甲苯脱蜡、下行乙醇脱水HE染色，光学显微镜下（×400倍）观察心肌组织形态学及病理变化并摄片。

1.8 统计学方法

本文实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料的数据用xˉ±s表示，组间比较采用方差分析，两组比较采用两独立样本t检验进行处理。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹蛭降糖胶囊对各组大鼠血糖、血脂的影响

如表1所示，造模后，与正常组相比，模型组大鼠血糖、HbA1c水平显著升高（P＜0.01）。用药8周后，与模型组相比，DJC高、低剂量组和吡格列酮组血糖、HbA1c水平明显下降（P＜0.01）。与正常组相比，模型组TG、TC、LDL-C水平均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组相比，DJC高剂量组TG、TC、LDL-C水平均明显降低（P＜0.01或P＜0.05）。吡格列酮组疗效与DJC高剂量组相近，两组比较无明显差异（P＞0.05），相关分析提示TLR-4与血脂具有相关性，TLR4与TG的相关系数为0.420，与TC的相关系数为0.310。

表1 丹蛭降糖胶囊对血糖血脂的影响（n=8）

2.2 丹蛭降糖胶囊对各组大鼠心肌组织TRL-4、TNF-α及IL-8表达的影响

如表2所示，正常组心肌组织TLR4表达较少；与正常组相比，模型组大鼠心肌组织TLR4表达明显增加（P＜0.01）；DJC灌胃8周后，与模型组相比，DJC高剂量组心肌组织TLR4表达明显减少（P＜0.01）；低剂量DJC的疗效弱于高剂量DJC（P＜0.05）。与吡格列酮组相比，DJC高剂量组心肌组织TLR4含量明显增加（P＜0.05）。

与正常组相比，模型组大鼠心肌组织TNF-α、IL-8水平明显升高（P＜0.01）。治疗8周后，与模型组相比，DJC高、低剂量组TNF-α、IL-8表达明显减少（P＜0.01或P＜0.05）；DJC高、低剂量组和西药组相比无明显差异。

2.3 各组大鼠心肌组织TRL-4、TNF-α和IL-8灰度值变化

如表3所示，造模后，与正常组相比，模型组心肌组织TRL-4、TNF-α和IL-8灰度值明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，DJC高、低剂量组和吡格列酮组心肌组织TRL-4、TNF-α和IL-8灰度值明显下降（P＜0.01或P＜0.05）；与吡格列酮组比较，DJC高、低剂量组灰度值较高（P＜0.05）。

2.4 各组大鼠心肌组织病理变化

图1可见正常组心脏结构完整、清晰，心肌细胞索以中央静脉为中心呈放射状规则排列，心肌纤维正常，细胞结构清晰，未见炎性细胞浸润。模型组心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增宽，心肌纤维出现断裂、重排及变性坏死，心肌组织间隙见炎性细胞浸润。DJC高剂量组心脏病理改变与模型组比较明显减轻，心肌细胞形态基本正常，排列较整齐，心肌纤维无明显的断裂和变性坏死，有极少量炎性细胞浸润。吡格列酮组的变化同DJC低组。改善程度弱于DJC高剂量组，心肌细胞形态基本正常，有少量炎性细胞浸润。

表2 丹蛭降糖胶囊对心肌组织TRL-4、TNF-α和IL-8表达的影响（n=8）

表3 各组大鼠心肌组织TLR4、TNF-α、IL-8表达灰度值

图1 DJC对糖尿病大鼠心脏病理的影响（HE×400）

2.5 各组大鼠心肌组织TLR4蛋白表达

经软件分析获得相应灰度值，以β-Actin为内参，计算TLR4蛋白的相对表达量（见图2）。与正常组比较，模型组大鼠心肌组织TLR4蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，DJC高、低剂量组和吡格列酮组大鼠心肌组织TLR4蛋白表达水平明显降低（P＜0.01或P＜0.05）。DJC高、低剂量组与西药组比较无明显差异（P＞0.05）。详见图3。

2.6 丹蛭降糖胶囊对各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-8蛋白表达的影响

如图4所示，与正常组相比，模型组大鼠心肌组织TNF-α、IL-8蛋白含量明显增加（P＜0.01）；与模型组相比，DJC高、低剂量组和吡格列酮组心肌组织TNF-α、 IL-8蛋白表达明显减少（P＜0.01或P＜0.05）。

图2 丹蛭降糖胶囊对大鼠心肌组织TLR4蛋白表达的影响

图3 各组大鼠心肌组织TLR4蛋白表达

3 讨论

目前糖尿病合并心肌病、冠心病的具体发病机制尚未完全阐明，但越来越多的研究表明糖代谢异常与心血管疾病可能存在共同的发病基础。有学者指出，炎症是冠心病与2型糖尿病共同的病理基础，而糖尿病心肌病、冠心病既是一种心血管疾病，也是一种炎症性疾病，其内在联系是慢性炎症这一共同的前期因子[1,4]。大量研究报道显示，TLR4信号通路为炎性通路的重要组成部分，可能参与高血压病、心室重构的发生发展，而TLR4刺激心脏增加了炎性因子的表达，包括：TNF-α、IL-6、IL-8等。这些炎症因子正是导致心肌细胞损伤、心肌肥厚、心肌纤维化、心室重构的重要因素[1,2,4,6]。TLR4与人类动脉粥样硬化的关系最为密切，作为新的炎症信号传递门户蛋白，是免疫反应、慢性炎症、氧化应激、脂代谢紊乱、胰岛素抵抗间的桥梁，激活TLR4可引起一系列炎症反应，促进肥胖、动脉粥样硬化等代谢性疾病的形成，最终激活TNF-α、IL-8、MCP-1等多种炎性因子的转录和合成，诱发各种炎症反应。本研究观察了DJC对糖尿病大鼠心肌组织TLR4、IL-8、TNF-α和心肌组织形态的影响。其中，模型组TLR-4表达量及灰度值的变化较正常组明显升高，而DJC高、低组与吡咯列酮组明显降低了TLR-4的表达量及灰度值，与模型组比较差异性显著。进一步用Western Blot法进行测定，证明予DJC干预后，大鼠心脏TLR-4表达明显减少，提示TLR4可能参与了糖尿病心肌病动脉硬化形成过程，引起一系列炎症反应，使心肌细胞发生器质性病变，促进动脉粥样硬化及糖尿病心肌病、冠心病的发生[5,6]。抑制心肌组织TLR4的高表达，有助于改善血管的氧化应激反应，改善炎症反应造成的心肌缺血，降低下游相关炎症介质的释放，如：TNF-α、IL-8。

图4 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-8表达情况

TNF-α是目前公认的炎性因子，由单核-巨噬细胞分泌，可使炎性细胞聚集、粘附，微血管扩张，诱发炎性反应[7,8]。本次实验结果证实，模型组大鼠心肌组织TNF-α水平明显高于正常对照组，药物干预8周后，DJC高、低剂量组大鼠心肌组织TNF-α水平明显降低，提示DJC可抑制糖尿病模型大鼠心脏TNF-α的高表达，证实DJC可抑制心脏TNF-α生成，减轻心肌组织炎症反应。

IL-8也是由单核-巨噬细胞产生的一种细胞因子，使中性粒细胞趋化、脱颗粒、释放溶酶，加强炎症反应，在疾病发生发展中起重要作用，是一种典型的炎症介质[9]。本次实验结果显示，糖尿病大鼠心肌组织IL-8表达明显高于正常组，服用DJC后，心肌组织IL-8明显降低，说明DJC可抑制炎症因子IL-8的高表达，在糖尿病心肌病变中起到保护作用。

心肌组织病理学观察提示，糖尿病大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增宽，心肌纤维出现断裂、重排和变性坏死，组织间隙见炎细胞浸润；服用DJC后，心肌组织形态明显改善，心肌细胞形态基本正常，排列比较整齐，心肌纤维无明显的断裂、变性坏死，仅有少量炎性细胞浸润。以上再次说明DJC可减少促炎性细胞的形成，降低炎症反应，减轻病理损伤，达到保护心脏的作用。

分析DJC的作用机制与本方的药物组成相关，方中水蛭味咸、苦辛平，有破血通经、逐瘀消癥的功效。现代药理证实水蛭能够降低有形斑块脂质，疏通血脉的功效；能降低血脂，祛除瘀血，对血液循环有明显的调节和改善作用。水蛭还能降低甘油三酯，降低血粘度，净化血液，祛除瘀血[10]。张竞之等[11]研究表明丹皮对TLR4高表达有明显抑制作用，早期呈剂量依赖性地阻断炎症反应，可作为TLR4的抑制剂，调控细胞内TLR4表达。生地有明确的抗炎作用，对鹿角菜胶所致的大鼠足部肿胀有显著的抑制作用，能降低毛细血管通透性，甙类部分对炎症的疗效是通过抑制血小板聚集，抗病原微生物而发挥作用[12]。徐晖[13]研究证实泽泻20 g·kg-1能明显减轻二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀、抑制大鼠棉球肉芽组织增生，而对血清抗体含量及大鼠肾上腺内抗坏血酸含量无显著影响。太子参具有提高免疫力的作用，大鼠在用药之后左室指数显著增加[14]。本文血糖血脂的疗效，与以往的报道一致，DJC有明确的降糖调脂疗效[15]。

综上所述，本方对心脏的保护作用机制，可能是通过消除炎性细胞，降低心肌组织TLR4高表达，减轻心脏病理损伤，下调TNF-α和IL-8表达，调节代谢性疾病共同炎症环境，降低血糖血脂，从而改善糖尿病心肌病变，并为临床应用提供可靠的实验及理论依据。

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Impactsof Dan Zhi Jiang Tang Capsuleon M yocardial TLR4,TNF-αand IL-8 and the Cardiopathologic Changes in Diabetic Rats

LiZhongnan,Cheng Lihua,Ma Chao,Dou Demei,Xing Yuting,Xing Yanyang
(The FirstAffiliated HospitalofAnhuiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Hefei230031,China)

This study chiefly aimed at investigating the effects of Dan Zhi Jiang Tang Capsule(DJC)onmyocardial Tolllike receptor 4(TLR4),tumor necrosis factorα(TNFα)and interleukin-8(IL-8)and the cardiopathologic changes in diabetic rats.Fiftymale rats,excluding 8 rats in the control group,had been administered with high fat forage for 4 weeks,which established the diabetic ratmodel combined with the intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)at 35mg·kg-1.The establishedmodel ratswere randomly divided into themodelgroup,the DJC high-dose group,the DJC low-dose group and the pioglitazone group.The rats in the model group and the control group were intragastrically administered with DJC at 1.08 and 0.54 g·kg-1each day,while those of the pioglitazone group were treated with pioglitazone at10mg·kg-1each day,and those of themodelgroup and controlgroup with saline of the same volume.The administrations lasted 8 weeks with the continues high-fat diet.The levels of TLR4,TNFαand IL-8 protein in myocardium of the rats were determined,and so were the blood glucose,HbA1cand blood lipids.Compared with the control group,the expressions ofmyocardial TLR4,TNFαand IL-8 in themodelgroup were significantly increased(P＜0.01).The expressionsof TLR4,TNFαand IL-8 in the DJChigh-dose and low-dose groupswere significantly decreased (P＜0.05 or P＜0.01).The cardiopathological report showed severe myocardial lesion in the model group.However, myocardial lesion in the DJChigh-dose group was significantlymitigated,which presented better therapeutic effects than the DJC low-dose group and the pioglitazone group.The levels of blood glucose,HbA1c,TG,TC,LDL-C in themodel group were significantly higher than those in the control group(P＜0.05 or P＜0.01).The levels of blood glucose,HbA1c,TG,TC and LDL-C were significantly decreased in the DJC high-dose and low-dose groups in comparison with the model group(P＜0.05 or P＜0.01).In conclusion,DJC down-regulated the expressions of TLR4,TNFαand IL-8 and improved the degree ofmyocardial lesion in the diabetic rats,showing favorablehypoglycemic and lipid-lowering effects.

Dan Zhi Jiang Tang Capsule,cardiopathology,Toll-like receptor 4,tumor necrosis factorα,interleukin-8

10.11842/wst.2017.02.022

R29

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-06-08

修回日期：2017-01-13

＊国家中医药管理局中医临床研究基地业务建设科研专项（JDZX2012004）：益气养阴活血法对糖尿病亚临床血管病变炎症因子的机理研究，负责人：李中南。

＊＊通讯作者：李中南，主任医师，主要研究方向：老年内分泌疾病和风湿病。