B6AF1雌性小鼠免疫性卵巢早衰模型建立＊

王佩娟，陈思，卢燕

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院南京210028；2.江苏省中医药研究院南京210028）

B6AF1雌性小鼠免疫性卵巢早衰模型建立＊

王佩娟1,2＊＊，陈思1,2，卢燕1,2

（1.南京中医药大学附属中西医结合医院南京210028；2.江苏省中医药研究院南京210028）

目的：本文主要研究自身免疫性卵巢早衰小鼠模型的建立和鉴定方法，为治疗和预防免疫性卵巢早衰提供实验基础。方法：将A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠进行杂交繁殖B6AF1小鼠，筛选出B6AF1雌性小鼠，运用透明带多肽片段ZP3免疫B6AF1雌性小鼠，对阴道脱落细胞进行巴士染色，第14天结束造模，第7天和第14天分别进行模型鉴定。将卵巢进行H&E染色和ZP3免疫荧光染色，采用ELISA法检测小鼠血清中E2和FSH的含量，来观察小鼠动情周期、卵巢组织形态学、抗透明带抗体免疫荧光和相关性激素的变化，评判免疫性卵巢早衰模型小鼠建立情况。结果：利用透明带ZP3多肽免疫B6AF1雌性小鼠14天，小鼠动情周期紊乱，卵巢组织有炎细胞浸润，卵巢中有明显透明带出现，血清中性激素E2含量下降和FSH含量上升，第7天上述变化不明显。结论：利用透明带多肽ZP3免疫B6AF1雌性小鼠14天，能够成功建立自身免疫性卵巢早衰模型，该模型发病率高，方法简单，能为免疫性卵巢早衰的研究提供基础。

卵巢早衰B6AF1雌性小鼠动物模型免疫学

卵巢早衰（Premature Ovarian Failure，POF）是指女性在40岁之前因为卵巢功能衰竭所致的闭经。其主要特点为患者体内雌激素水平低落，垂体卵泡刺激素及黄体生成素水平失去抑制而升高[1,2]。临床表现为原发或继发闭经、不孕、低雌激素等症状，该病致病因素多样，具体发病机制目前尚不明确[3,4]。现代医学认为与POF密切相关的因素有家族致病基因遗传、特定酶功能缺陷、机体免疫系统紊乱、手术或放化疗过程中的医源性损伤、环境中的毒素和不良应激等，其中机体免疫功能紊乱导致POF已经越来越受到重视。据统计发现，约5%-30%的POF患者自身免疫功能出现异常[5-7]。目前临床POF的诊断仍以临床表现和血清内分泌学检查为主，很少进行组织病理学检查，这使得POF研究工作受限[8,9]。

因此，建立一种操作方法简单、发病率较高的POF动物模型，将为科研及临床工作研究免疫性POF提供便利的条件。目前常用的免疫性POF动物模型有多种，有的用粗制的卵巢抗原来免疫实验动物，有的对初生小鼠进行胸腺切除术来建立模型，也有研究用透明带抗原肽来免疫实验动物，不同的建模方法均具有不同的优缺点。本研究综合了之前免疫性POF模型建立的研究成果，利用ZP3330-342多肽片段免疫B6AF1雌性小鼠，从而构建免疫性POF动物模型，结果表明这种方法切实可行，不仅成模率高，而且操作简单、重复性好，对POF的研究具有很大帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物

A/J雄性小鼠和C57BL/6雌性小鼠，6-8周龄，体质量20 g，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号为SCXK（沪）2008-0016，饲养环境为SPF级，室温22-25℃，湿度40%-70%，符合国家标准。小鼠自由饮食，白天和黑夜时长各12 h。将A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠进行杂交，繁育出B6AF1小鼠，4周龄时筛选雌性小鼠，以备免疫性POF造模使用。

1.2 试剂

透明带多肽ZP3330-342（NSSSSQFQIHGPR），分析纯度＞95%，由上海吉尔生化有限公司合成。巴士染色液、苏木素、伊红和荧光染色固定液均购自南京建成生物研究所。甲醛、乙醇、苦味酸和中性树脂均购自国药试剂有限公司。检测血清中E2和FSH的ELISA试剂盒均购自美国eBioscience公司。不完全弗氏佐剂和结核杆菌均购自美国Sigma公司。抗透明带抗体购自英国Abcam公司。荧光二抗购自美国CST公司。抗荧光淬灭封片液购自碧云天有限公司。

1.3 仪器

倒置荧光显微镜购自德国Carl Zeiss公司（型号：Axio Observer A1）；石蜡切片机购自德国Leica公司（型号：RM2245）；组织脱水机、石蜡包埋机、冰台、烤片机和烘箱均购自湖北定源医疗设备有限公司（型号：CJ-12P、CB-08、CT-9、CT-9D和DGT-G）；全自动全长酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司（型号：Multiskan Spectrum）。

1.4 动物模型建立

筛选雌性B6AF1小鼠46只，随机分为正常组23只、模型组23只。用弗氏不完全佐剂配制结核分支杆菌，使其浓度为3.3mg·mL-1，充分混匀。用去离子水配制透明带多肽，使其浓度达到1mmol·L-1，充分混匀。将配制好的完全弗氏佐剂和ZP3多肽液在冰上进行混合，用注射器来回抽打，制成油包水的状态。将制备好的混匀液注射到模型组小鼠的尾根部和一侧后脚掌的皮下组织，共注射0.1mL，空白组注射等体积的生理盐水。从造模之日起（第0天）每天观察小鼠的动情周期，第7天处死6只小鼠（正常组3只、模型组3只），留取血清和卵巢组织，鉴定模型。第14天，处死剩余小鼠，进行模型鉴定。

1.5 巴士染色

每天上午8点开始观察动情周期。取少量无菌棉球裹在牙签钝头上，沾取少量生理盐水于小鼠阴道内轻刮一下，将刮取物均匀涂于乙醇浸泡过的载破片上，之后进行巴士染色，普通光学显微镜观察并拍照，判断小鼠动情周期的紊乱情况。

1.6 病理组织观察

小鼠出死后将左右卵巢均取出，将一侧卵巢放入Bouin氏固定液中，固定24 h后进行组织脱水，石蜡包埋后进行5μm切片，展片后拷片3 h，进行H&E染色，观察卵巢组织的形态变化及炎症细胞浸润情况。另一侧卵巢进行冰冻切片，将制作好的冰冻切片放入95%乙醇固定30min，切片取出放于晾片板上，吸取少量BSA溶液滴于切片上，PBS洗一次，再将片子取出，用配制好的BSA溶液将Donkey Anti-Mouse IgG稀释成1∶200，在每张片子上滴1mL稀释好的溶液，4℃避光孵育过夜，第2天将片子取出，PBS洗3次，吸取50μL抗荧光淬灭封片液滴于每张片子上，用盖玻片封住片子，用荧光显微镜观察，透明带抗体的分布情况。

1.7 ELISA检测E2和FSH

小鼠摘眼球取血，放于促凝管中，3 500 r·min-1离心5 min，吸取上清液，血清保存在-80℃中，利用ELISA试剂盒检测血清中的雌激素和刺卵泡激素，加50μL的血清样本到96孔板的检测孔（提前孵育好了检测抗体）中，抗原抗体在37℃中孵育1 h，洗3遍，加入显色液，5min后加入终止液，用全波长酶标仪在450 nm处进行检测E2和FSH的含量。

1.8 统计学方法

实验数据在SPSS 17.0中统计处理，结果均采用xˉ±s的形式表示，两组间比较用Students t检验，P＜0.05认为结果有统计学意义。作图用Graphpad prism 6.0软件。

2 结果

2.1 免疫性卵巢早衰模型小鼠动情周期紊乱

每天连续刮取小鼠的阴道脱落细胞，进行巴士染色后观察动情周期变化情况，图1指出了小鼠不同动情周期的变化特点，小鼠动情周期一般为4-5天，表现为以有核细胞为主的动情前期，无核角化细胞为主的动情期，白细胞为主的动情后期，三者共存的动情间期，4个周期反复循环，如图1所示。

由表1统计表明，与空白组相比较，模型组B6AF1雌性小鼠的动情周期出现了严重的紊乱。空白对照组小鼠动情周期正常，无明显变化。去除第7天杀死的6只小鼠，对20只空白组和20只模型组小鼠进行脱落细胞分析，模型组小鼠动情周期紊乱18只，动情周期延长、动情周期停滞、无明显动情周期3种情况均有表现。各组小鼠动情周期紊乱的比例分别为：空白组5%（1/20）、模型组90%（18/20）。

图1 卵巢早衰小鼠脱落细胞的巴士染色（100×）

表1 造模后小鼠动情周期改变情况比较（n=20）

图2 卵巢早衰小鼠卵巢组织H&E染色（400×）

图3 卵巢早衰小鼠卵巢组织透明带分布（100×）

2.2 免疫性卵巢早衰模型小鼠卵巢病理和透明带分布观察

对小鼠卵巢组织切片进行H&E染色，结果如图2所示，模型组小鼠卵巢发生明显的炎症反应。空白组卵巢组织中各级卵泡清晰可见，卵泡及卵母细胞形态规则，颗粒细胞排列整齐，淋巴细胞和浆细胞很少浸润。模型组（第7天）小鼠卵巢中各细胞形态尚规则，但排列紊乱，炎细胞浸润情况不明显；模型组（第14天）小鼠卵巢中可见大量闭锁卵泡，卵泡细胞形态不规则，颗粒细胞排列紊乱，卵泡及间质见淋巴细胞和浆细胞浸润。这说明ZP3多肽免疫小鼠14天后，POF模型小鼠的卵巢组织有炎细胞浸润。

对卵巢组织冰冻切片后进行抗透明带抗体荧光染色。图3、图4显示空白组未见明显透明带荧光。模型组（第14天）小鼠卵巢中可见数个大小不等的黄绿色透明带荧光区，而模型组（第7天）透明带荧光较小，且颜色较淡。ZP3免疫荧光染色提示，第7天免疫性POF模型小鼠卵巢中已有明显透明带出现，分泌出了透明带抗体。第14天时透明带较明显，小鼠发生了明显的自身免疫性疾病。

图4 卵巢早衰小鼠卵巢组织透明带分布（400×）

2.3 ELISA法检测小鼠血清中E2和FSH含量

采用抗体双夹心法ELISA检测各组小鼠血清中E2和FSH的含量，全自动酶标仪上测定OD450nm和OD630nm后根据标准曲线计算血清中E2和FSH的含量。结果如图5所示，与空白组相比较，模型组小鼠在第7天和第14天血清E2水平均下调，但第14天血E2水平下降更明显。（P＜0.01），模型组中FSH水平明显上调，第7天上升不明显（P＞0.05），第14天上升明显（P＜0.01）。

图5 血清中E2和FSH的含量

3 讨论

POF是一种复杂的疾病，目前研究较少，免疫系统紊乱与POF的发生密切相关，现有研究主要围绕多种致病抗体的形成和T淋巴细胞亚群的失衡进行[7,10,11]。免疫性POF模型动物的建立对研究该病发病机制和治疗方法的研究具有重要意义。迄今建立POF模型动物的方法多样，但均有各自的优缺点[12-14]。①用粗制的卵巢抗原免疫动物，第14天卵巢组织学检查见卵泡组织内及颗粒细胞中有大量的淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润[5]；但只有始基卵泡和小部分次级卵泡受累，卵泡与黄体的数量减少、闭锁卵泡增加，有一定的局限性。②初生小鼠胸腺切除模型，虽然这种方法所建立的模型与人类POF相似，但给出生3天以内的小鼠行胸腺切除术，手术难度大，小鼠的死亡率高，目前难以推广应用。③用ZP抗原免疫动物产生卵巢炎，目前已有研究认为ZP抗体影响卵泡各不同阶段ZP蛋白的合成[8]，因ZP蛋白存在于哺乳动物中，哺乳动物和人的ZP3具有一定的同源性，可用于人类POF的研究，但其模型成功率低，有待进一步改进。④用小鼠透明带ZP3第330-342个氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR）于小鼠双后脚掌处进行皮下注射免疫动物而建模，成模率比较高，在卵巢形态学的表现与人类POF自身免疫性卵巢炎相似，有利于进行临床诊断学和治疗学方面的研究。

本课题组借鉴了之前免疫性卵巢早衰模型建立的各种方法，选用用透明带多肽（pZP3）建造的自身免疫性POF动物模型。同时，国内外多项研究表明，由A/J雄鼠和C57BL/6雌鼠进行杂交繁殖出的B6AF1雌鼠建立自身免疫性疾病的动物模型的成模率达90%以上[10-13]，所以，本研究选用B6AF1雌鼠作为研究对象，用透明带ZP3的特定序列，第330-342个氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR）来免疫小鼠，建立自身免疫性POF动物模型。本研究表明，造模第14天，模型小鼠卵巢H&E染色有明显的炎症发生，且有明显透明带出现在卵巢组织中，同时性激素E2水平明显下降，FSH水平明显上升，能较好地模拟临床POF血清学变化，证实造模成功。因此，用透明带ZP3多肽诱导B6AF1雌鼠自身免疫性POF模型，发病率高，方法简单，是一种很好的实验方法。注射ZP3免疫B6AF1小鼠建立自身免疫性POF不仅克服了手术切除胸腺造模的技术问题，还改善了粗制抗原建立POF的弊端，使模型小鼠卵巢组织学表现同人类自身免疫性卵巢炎相符，有利于进行临床诊断学和治疗学方面的研究，是理想的转化医学的研究模式。

目前，POF发病机制尚不明确，自身免疫异常是POF发病的一个重要因素，POF的自身免疫紊乱包括细胞免疫和体液免疫紊乱，体现在各类相关自身抗体、细胞因子、T淋巴细胞亚群等方面，这些相关免疫功能紊乱最终会导致卵泡的缺失或卵泡对促性腺激素的反应低下，引发POF。已经证实抗透明带抗体因可以加速卵母细胞的破坏和耗竭而致POF[6,7]。但透明带抗体引起免疫生殖损坏的具体机制尚不明确，研究发现CD4+CD25+Treg是具有保护作用的T细胞亚群之一，致炎因子Th17异常是引起免疫损害的重要因子[15]。抗透明带抗体是否通过CD4+CD25+Treg/Th17比例影响卵巢功能有待进一步研究发现。

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Abstract:This study aimed at exploring the modeling and identification method of autoimmune POF by the ZP3 polypeptide with the provision of scientific basis for the prevention and treatment of POF.B6AF1 female mice,the hybridization of A/Jmale mice and C57BL/6 female mice,was immunized by zona pellucida polypeptide fragments. Then,themice estrous cyclewas detected by vaginal exfoliated cells Pasteur's staining.After the 14-daymodeling,the mice model was identified on the 7thand 14thday,respectively.Ovarian tissue morphology and anti-zona pellucida antibodies immunofluorescence change were detected by H&E staining and ZP3 immunofluorescence staining.Serum hormone levels of E2and FSH in themice were tested by ELISA,with the combination of estrous cycle,ovarian tissue morphology and anti-zona pellucida antibodies immunofluorescence change to judge the success of the POFmicemodel. It was found that ZP3 polypeptide immunized mice appeared the disorder of estrous cycle after 14 days,so did the marked inflammation observed by ovarian biopsy,a clear transparentzone by ZP3 immunofluorescence staining,and the decrease of serum E2declined and the increase of serum FSH by ELISA.However,no significant change was found on the 7thday in the modeling.In conclusion,ZP3 polypeptide induced autoimmune POF mice model was established successfully,featuring high incidence and simplemethod and laying a foundation for the further study of autoimmune POF.

The Establishment of Autoimmune PrematureOvarian Failure(POF)M odelUsing B6AF1 FemaleM ice

Wang Peijuan1,2,Chen Si1,2,Lu Yan1,2
(1.Affiliated HospitalofTraditionalChineseandWestern Medicine,Nanjing University of ChineseMedicine,Nanjing 210028,China; 2.Jiangsu Province Institute ofTraditionalChineseMedicine,Nanjing 210028,China)

Premature ovarian failure,B6AF1 femalemice,mousemodel,immunology

10.11842/wst.2017.02.021

R2-03

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-12-24

修回日期：2017-01-19

＊国家自然科学基金委青年科学基金项目（81303136）：从诱导调节性T细胞分化探讨补肾活血中药治疗免疫性卵巢早衰的机制研究，负责人：卢燕；江苏省科学技术厅自然基金面上项目（BK20151606）：补肾活血汤对制动应激生殖损害大鼠HPA轴及海马内质网应激调控的影响，负责人：王佩娟；江苏省中医药管理局项目（LZ13088）：从Treg角度研究补肾活血汤保护雌性大鼠应激生殖损害的免疫学机制，负责人：王佩娟。

＊＊通讯作者：王佩娟，主任中医师，教授，主要研究方向：妇产科内分泌疾病的中西医结合诊疗。