不同频率电针治疗阿尔茨海默病大鼠神经性病变的机制研究

高 珊，孔立红，余超超，姚国晋

·论著·

不同频率电针治疗阿尔茨海默病大鼠神经性病变的机制研究

高 珊，孔立红*，余超超，姚国晋

目的 探讨不同频率电针治疗阿尔茨海默病(AD)大鼠神经性病变的机制，为临床上采用电针治疗AD提供理论依据。方法 2016年3—6月，选择健康的SPF级Wistar雄性大鼠90只，适应性饲养1周后进行Morris水迷宫实验，筛选合格后按照随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组和50 Hz电针治疗组(每组15只)。正常组不做任何处理。模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组和50 Hz电针治疗组注射寡聚体Aβ1-42溶液建造AD模型。假手术组采用0.9 %氯化钠溶液建造假手术模型，并再次进行Morris水迷宫实验确认造模成功。造模完成后，2 Hz电针治疗组采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪针刺百会穴、肾俞穴进行治疗，30 Hz电针治疗组和50 Hz电针治疗组除电针频率分别选择30 Hz和50 Hz外，其他所有参数和操作同2 Hz电针治疗组。正常组、模型组、假手术组与2 Hz、30 Hz、50 Hz电针治疗组同样进行抓取，但不做任何处理后放回。治疗结束后处死各组大鼠，取大脑海马区、皮质区组织待测。采用Western blotting法检测各组大脑海马区、皮质区Tau蛋白及其磷酸化〔Tau(pS262)、Tau(pS396)、Tau(pS404)〕、14-3-3ζ、α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)表达水平。结果 模型组大脑海马区Tau表达水平低于正常组，Tau(pS262)、Tau(pS396)表达水平高于正常组(P<0.05)；50 Hz电针治疗组Tau表达水平高于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，Tau(pS262)、Tau(pS396)表达水平低于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组(P<0.05)。模型组大脑皮质区Tau表达水平低于正常组，Tau(pS262)、Tau(pS404)表达水平高于正常组(P<0.05)；50 Hz电针治疗组Tau表达水平高于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，Tau(pS404)表达水平低于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组(P<0.05)。模型组大脑海马区、皮质区14-3-3ζ表达水平高于正常组，海马区AMPA表达水平低于正常组(P<0.05)；50 Hz电针治疗组大脑海马区、皮质区14-3-3ζ表达水平低于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，海马区AMPA表达水平高于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组(P<0.05)。结论 不同电针治疗AD大鼠可能是通过调节Tau蛋白及其磷酸化水平以及相关蛋白(14-3-3ζ、AMPA受体蛋白)的表达水平来改善AD大鼠的神经性病变，进而达到治疗AD的效果。

阿尔茨海默病；电针；Tau蛋白质类

高珊，孔立红，余超超，等.不同频率电针治疗阿尔茨海默病大鼠神经性病变的机制研究[J].中国全科医学，2017，20(12)：1449-1456.[www.chinagp.net]

GAO S,KONG L H,YU C C,et al.Mechanism of different frequencies of electroacupuncture in treating neuropathy in rats with Alzheimer′s disease [J].Chinese General Practice，2017，20(12)：1449-1456.

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种起病隐匿的慢性进行性发展的神经退行性疾病，又称老年痴呆，其主要的病理改变为老年斑(senile plaques，SP)和神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神经元的损伤和丢失[1]。神经元微管相关蛋白Tau蛋白的异常磷酸化能够形成双螺旋细丝(PHF)，是NFTs发生、发展的重要原因[2]。Tau蛋白的异常磷酸化还会影响α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体的数量，造成AMPA受体功能异常，引发认知功能障碍[3]。此外，14-3-3β/ζ蛋白与异常磷酸化的Tau蛋白关系密切，参与AD时NFTs的形成，与AD的患病进程呈正相关[4]。本研究针对AD大鼠采用不同频率的电针(低、中、高频)对百会穴、肾俞穴[1,5]进行针刺治疗，采用Western blotting法和石蜡切片免疫荧光法从蛋白水平分别检测各组大鼠治疗前后的Tau蛋白及其磷酸化和14-3-3ζ、AMPA受体蛋白，观察不同频率电针对Tau蛋白及其磷酸化水平和14-3-3ζ、AMPA受体蛋白的影响，以探讨不同频率电针治疗AD大鼠神经性病变的机制，为临床上采用电针治疗AD提供理论依据。

本研究创新之处：

从Tau蛋白及下游靶蛋白表达水平的角度研究不同频率电针治疗阿尔茨海默病的分子机制。从海马和皮质两方面探讨不同频率电针刺激对阿尔茨海默病大鼠脑中Tau及其磷酸化和下游蛋白的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康的SPF级Wistar雄性大鼠90只，4～5个月，体质量(300±50)g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-0005，屏障环境饲养，平均温度(22±2)℃，湿度55%左右。整个动物实验过程遵守实验动物伦理学规定。

1.2 实验仪器 DW-5大鼠脑立体定位仪和Morris水迷宫系统购于成都泰盟科技有限公司；G6805-Ⅱ型电针治疗仪购于上海医疗器械股份有限公司；HT7700透射电镜购于日立公司(日本)；EMUC7切片机和石蜡切片机购于莱卡公司(德国)；28号1寸不锈钢毫针购于苏州华佗医疗用品厂有限公司；IMS图像分析系统购于武汉华联科生物技术有限公司；倒置显微镜购于OLYMPUS公司(日本)；全自动化学发光分析仪购于上海天能科技有限公司。

1.3 Morris水迷宫实验及空间探索实验 (1)Morris水迷宫实验装置及动态图像分析系统：迷宫水池中的平台位于第3象限正中，水面高出平台1 cm，将大鼠面向池壁分别从4个象限放入池中，由计算机记录各种参数。大鼠2 min内找到并爬上平台的时间即为逃避潜伏期，逃避潜伏期最长为2 min。如果大鼠2 min内未找到平台，需将其牵引至平台，这时逃避潜伏期记录为2 min。2次/d，连续记录5 d大鼠找到平台所需的逃避潜伏期及运动轨迹，然后计算测试结果的平均成绩。(2)空间探索实验：第5天撤去平台，任意选择一个入水点将大鼠放入池中，记录大鼠的运动轨迹，并计算大鼠跨越平台的时间和次数。

1.4 实验时间及分组 2016年3—6月，将90只SPF级Wistar雄性大鼠适应性饲养1周后进行Morris水迷宫实验，检测大鼠的行为记忆能力，筛选并剔除不合格大鼠(平均逃避潜伏期>2 min)，并随机补充至90只。将筛选出的合格SPF级Wistar雄性大鼠按照随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组和50 Hz电针治疗组，每组15只。

1.5 实验动物造模 正常组不做任何处理。模型组注射寡聚体Aβ1-42溶液建造AD模型，具体为：采用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为1 μg/μl的Aβ1-42溶液，置于37 ℃恒温箱中孵育7 d，使其变成具有神经毒性的寡聚体状态；大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉后，将其在DW-5大鼠脑立体定位仪上俯卧位固定，要求前后囟水平，将头皮剪开，使前囟充分暴露，并参照脑立体定位图谱予以定位，使用牙科钻在前囟门向后3.2 mm，中线左右分别旁开2.5 mm处，分别钻开一个直径为1 mm左右的小孔穿颅，将微量注射器针尖从颅骨表面缓慢垂直插入3.5 mm，分别到达双侧海马齿状回(DG)区；5 min内分别注射Aβ1-425 μl，注射完成后继续留针5 min，以1.0 mm/min速度拔针，以防止药物溢出；连续3 d。假手术组采用0.9 %氯化钠溶液建造假手术模型，具体处理方法与模型组相同，但在双侧脑室DG区注射5 μl 0.9 %氯化钠溶液，连续3 d。2 Hz、30 Hz、50 Hz电针治疗组均建造AD模型，具体方法与试剂同模型组。2周后(以造模第1天开始计算)对各组大鼠进行Morris水迷宫实验，记录各组大鼠平均逃避潜伏期和空间探索实验中在原平台象限的停留时间和次数，如果大鼠60 s内未找到平台，即认为造模成功。

1.6 治疗方法 造模完成后，2 Hz电针治疗组采用G6805-Ⅱ型电针治疗仪针刺百会穴、肾俞穴，百会穴向前平刺3～5 mm，肾俞穴稍向内斜刺5 mm，百会穴、肾俞穴分别接负极和正极，左右侧肾俞每日交替使用；选择连续波，频率2 Hz，电压2～4 V，电流1～2 mA，留针20 min；1次/d，7 d为1疗程，2个疗程间休息1 d，共治疗2个疗程。30 Hz电针治疗组和50 Hz电针治疗组除电针频率分别选择30 Hz和50 Hz外，其他所有参数和操作同2 Hz电针治疗组。正常组、模型组、假手术组与2 Hz、30 Hz、50 Hz电针治疗组同样进行抓取，但不做任何处理后放回。治疗结束后各组大鼠断头处死，迅速取脑组织，冰冻保存待测。

1.7 石蜡切片免疫荧光染色 将大鼠海马区组织和皮质区进行石蜡包埋与固定，对石蜡切片脱蜡至水，采用PBS(pH=7.4)洗涤3次，3 min/次，抗原修复后使用PBS洗涤3次，3 min/次；洗涤结束后将玻片置于3%双氧水中，湿盒孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，再采用PBS洗涤3次，3 min/次；加入一抗稀释液置于湿盒中4 ℃过夜或室温孵育1 h；孵育时间结束后使用PBS洗涤3次，5 min/次；洗涤后将玻片置于湿盒中，加入荧光二抗稀释液置于37 ℃孵育1 h(避光孵育)，孵育结束后采用PBS洗涤5次，3 min/次；最后在玻片上滴加抗荧光猝灭封片剂(含DAPI染色液)15～20 μl，盖上盖玻片，避免气泡。采用荧光显微镜进行观察，拍照记录〔抗体信息及稀释比例：Tau(ab80579；1∶100)、Tau(pS262)(ab131354；1∶100)、Tau(pS396)(ab109390；1∶50)、Tau(pS404)(ab131338；1∶200)〕。

1.8 Western blotting法检测大鼠海马区、皮质区组织中Tau蛋白及其磷酸化水平、14-3-3ζ受体蛋白水平、AMPA受体蛋白水平 将大鼠海马区组织和皮质区组织剪碎后加入一定量的组织裂解液，匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后4 ℃下12 000×g离心15 min，取上清液，采用BCA比色法测定蛋白含量。取10 μg加热变性的蛋白12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)转膜，然后加入5 %脱脂牛奶溶液进行封固，加一抗4 ℃振荡过夜，辣根过氧化物酶标记二抗结合1 h，采用ECL显色试剂盒显示目的条带，最后采用全自动化学发光分析仪进行检测。使用AlphaEaseFC软件对Western blotting图片进行灰度定量分析〔抗体信息及稀释比例：Tau(ab80579；1∶500)、Tau(pS262)(ab131354；1∶500)、Tau(pS396)(ab109390；1∶20 000)、Tau(pS404)(ab131338；1∶500)、14-3-3ζ(SC1019；1∶200)、AMPA(AB109450；1∶2 000)、β-actin(#4970；1∶1 000)〕。

2 结果

2.1 各组大脑海马区、皮质区Tau蛋白及其磷酸化水平比较 6组大脑海马区Tau(pS404)表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；6组大脑海马区Tau、Tau(pS262)、Tau(pS396)表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组大脑海马区Tau表达水平低于正常组，Tau(pS262)、Tau(pS396)表达水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；50 Hz电针治疗组Tau表达水平高于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，Tau(pS262)、Tau(pS396)表达水平低于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1、图1)。各组大鼠大脑海马区Tau蛋白及其磷酸化的免疫荧光结果同Western blotting结果一致(见图2～5，本文图2～5彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章)。6组大脑皮质区Tau(pS396)表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；6组大脑皮质区Tau、Tau(pS262)、Tau(pS404)表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组大脑皮质区Tau表达水平低于正常组，Tau(pS262)、Tau(pS404)表达水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；50 Hz电针治疗组Tau表达水平高于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，Tau(pS404)表达水平低于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图6)。

注：1～3为正常组，4～6为假手术组，7～9为模型组，10～11为2 Hz电针治疗组，12～13为30 Hz电针治疗组，14～16为50 Hz电针治疗组

图1 各组大鼠大脑海马区Tau蛋白及其磷酸化水平

Figure 1 Expression levels of Tau protein and phosphorylated Tau protein in the hippocampus of rats in 6 groups

表1 6组大脑海马区Tau、Tau(pS262)、Tau(pS396)、Tau(pS404)表达水平比较±s)

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与2 Hz电针治疗组比较，cP<0.05；与30 Hz电针治疗组比较，dP<0.05

注：A为正常组，B为假手术组，C为模型组，D为2 Hz电针治疗组，E为30 Hz电针治疗组，F为50 Hz电针治疗组

图2 6组大鼠海马区石蜡切片Tau蛋白水平(免疫荧光染色，×400)

Figure 2 Expression levels of Tau protein in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

注：A为正常组，B为假手术组，C为模型组，D为2 Hz电针治疗组，E为30 Hz电针治疗组，F为50 Hz电针治疗组

图3 6组大鼠海马区石蜡切片Tau(pS262)水平(免疫荧光染色，×400)

Figure 3 Expression levels of Tau(pS262) in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

注：A为正常组，B为假手术组，C为模型组，D为2 Hz电针治疗组，E为30 Hz电针治疗组，F为50 Hz电针治疗组

图4 6组大鼠海马区石蜡切片Tau(pS396)水平(免疫荧光染色，×400)

Figure 4 Expression levels of Tau(pS396)in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

注：A为正常组，B为假手术组，C为模型组，D为2 Hz电针治疗组，E为30 Hz电针治疗组，F为50 Hz电针治疗组

图5 6组大鼠海马区石蜡切片Tau(pS404)水平(免疫荧光染色，×400)

Figure 5 Expression levels of Tau(pS404)in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

表2 6组大脑皮质区Tau、Tau(pS262)、Tau(pS396)、Tau(pS404)表达水平比较±s)

注：与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与2 Hz电针治疗组比较，cP<0.05；与30 Hz电针治疗组比较，dP<0.05

2.2 各组大脑海马区、皮质区14-3-3ζ、AMPA表达水平比较 6组大脑皮质区AMPA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；6组大脑海马区14-3-3ζ、AMPA表达水平及大脑皮质区14-3-3ζ表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中模型组大脑海马区、皮质区14-3-3ζ表达水平高于正常组，海马区AMPA表达水平低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；50 Hz电针治疗组大脑海马区、皮质区14-3-3ζ表达水平低于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，海马区AMPA表达水平高于模型组、2 Hz电针治疗组、30 Hz电针治疗组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3、图7～8)。

表3 6组大脑海马区、皮质区14-3-3ζ、AMPA表达水平比较±s)

注：AMPA=α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸；与正常组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与2 Hz电针治疗组比较，cP<0.05；与30 Hz电针治疗组比较，dP<0.05

注：1～3为正常组，4～6为假手术组，7～9为模型组，10～11为2 Hz电针治疗组，12～13为30 Hz电针治疗组，14～16为50 Hz电针治疗组

图6 6组大鼠大脑皮质区Tau蛋白及其磷酸化水平

Figure 6 Expression levels of Tau protein and phosphorylated Tau protein in the cerebral cortex of rats in 6 groups

注：1～3为正常组，4～6为假手术组，7～9为模型组，10～11为2 Hz电针治疗组，12～13为30 Hz电针治疗组，14～16为50 Hz电针治疗组；AMPA=α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸

图7 6组大鼠大脑海马区14-3-3ζ、AMPA受体蛋白表达水平

Figure 7 Expression levels of 14-3-3ζ and AMPA receptor protein in the hippocampus of rats in 6 groups

注：1～3为正常组，4～6为假手术组，7～9为模型组，10～11为2 Hz电针治疗组，12～13为30 Hz电针治疗组，14～16为50 Hz电针治疗组

图8 6组大鼠大脑皮质区14-3-3ζ、AMPA受体蛋白表达水平

Figure 8 Expression levels of 14-3-3ζ and AMPA receptor protein in the cerebral cortex of rats in 6 groups

3 讨论

AD是老年人常见的多因素致病的中枢神经系统变性疾病，而NFTs是其主要的病理改变之一。Tau蛋白是神经元中最主要的微管相关蛋白，可促进微管组装并维持微管的稳定性。在AD形成过程中Tau蛋白的过度磷酸化扰乱微管的稳定性，以配对螺旋丝结构形成NFTs并聚积在神经元内[6-7]。此外，有研究显示，Tau蛋白的异常磷酸化与AD患者学习记忆障碍和神经变性的发生、发展有关系[3,8]。以上研究均表明，Tau蛋白的异常磷酸化在AD发病中起重要作用。14-3-3蛋白具有广泛的生物学功能，参与调节细胞周期进程，细胞凋亡、增殖、生存等基本生命进程。而卜碧涛等[4]、夏亦元[9]的实验也证实，14-3-3蛋白参与NFTs的形成，并参与调控Tau蛋白的磷酸化。此外，除NFTs外，神经突触可塑性改变也是AD发生的病理特征之一[10]。中枢神经系统棘突触后膜的兴奋性氨基酸受体AMPA受体数量的改变和受体转运是造成神经突触可塑性改变的重要因素之一[3]。研究发现，Tau蛋白的过度磷酸化能够显著减少突触后膜AMPA受体的数量，进而造成AMPA受体在突触后膜上的运输功能异常，最终导致认知功能障碍[3]。

临床研究显示，针灸治疗AD有一定疗效，且安全性较好，在疗效和总有效率上较药物治疗有优势[11]。对AD模型大鼠来说，电针治疗可通过改善AD模型大鼠海马区相关蛋白表达水平或者改善海马神经元的超微结构(神经元线粒体、突触形态可塑性等)来提高AD大鼠的学习记忆能力[10,12-13]。吴羽楠等[14]研究发现，电针治疗可通过抑制小鼠海马区Tau蛋白磷酸化水平来改善转基因痴呆模型小鼠的学习记忆能力。但电针治疗AD与Tau蛋白及其磷酸水平之间的关系还有待进一步研究。

此外，电针频率作为电针刺激的重要参数之一，不同频率的电针刺激对疾病的影响有所不同。肖贻财等[15]研究发现，不同电针频率对局灶性脑缺血大鼠脑星形胶质细胞的反应性不同，其中中频电针的效应最好，可能有神经保护作用，但100 Hz高频电针处理则无明显影响。而在张亢亢等[16]研究发现，电针能够通过增强突触可塑性实现对AD大鼠的治疗，且治疗作用与电针频率有关，50 Hz高频电针效果最佳。针对电针治疗神经疾病，有些是高频电针的作用优于低频电针，有些是低频电针的作用优于高频。

本研究构建AD大鼠模型，采用不同频率的电针仪针刺百会穴、肾俞穴治疗AD大鼠。与正常组比较，模型组大鼠大脑海马区、皮质区Tau表达水平降低，Tau蛋白磷酸化水平以及参与Tau蛋白磷酸化影响AD进程的14-3-3ζ蛋白水平均明显升高；此外，受Tau蛋白磷酸化水平影响的突触后膜AMPA受体蛋白的表达水平在AD大鼠海马区中明显下调。而使用电针治疗后，尤其是50 Hz电针治疗组大鼠Tau蛋白及其磷酸化水平均有所恢复，同时14-3-3ζ、AMPA受体蛋白水平也有所恢复；表明高频电针可改善AD大鼠的神经元纤维缠结，进而改善学习记忆能力。

综上所述，本研究提示不同频率电针治疗AD大鼠可能是通过调节Tau蛋白及其磷酸化水平以及相关蛋白的表达水平来改善AD大鼠的神经性病变，进而达到治疗AD的效果。

作者贡献：孔立红进行文章的构思与设计；高珊进行研究的实施与可行性分析、数据收集、撰写论文；余超超进行数据整理；姚国晋进行统计学处理；高珊、姚国晋进行结果的分析与解释；高珊、孔立红进行论文修订；孔立红进行负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

[1]LI W,KONG L H,WANG H,et al.High-frequency electroacupuncture evidently reinforces hippocampal synaptic transmission in Alzheimer′s disease rats[J].Neural Regen Res,2016,11(5):801-806.DOI:10.4103/1673-5374.182708.

[2]李羽薇,张卓伯.tau蛋白在阿尔茨海默病中的研究进展[J].现代医学,2016,44(6):910-914.DOI:10.3969/j.issn.1671-7562.2016.06.039. LI Y W,ZHANG Z B.Research progress of tau protein in Alzheimer′s disease[J].Modern Medical Journal,2016,44(6):910-914.DOI:10.3969/j.issn.1671-7562.2016.06.039.[3]林杭,王伟文,李薇,等.Tau蛋白过度磷酸化对突触后膜AMPA受体数量及功能的影响[J].中国老年学杂志,2013,33(21):5364-5366.DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2013.21.073. LIN H,WANG W W,LI W,et al.Effect on receptor number and function of AMPA by depphosphorylated Tau protein[J].Chinese Journal of Gerontology,2013,33(21):5364-5366.DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2013.21.073.

[4]卜碧涛,张旻,王伟,等.14-3-3蛋白与阿尔茨海默病tau蛋白异常磷酸化的关系[J].中华神经科杂志,2005,38(10):620-623.DOI:10.3760/j.issn:1006-7876.2005.10.006. BU B T,ZHANG M,WANG W,et al.Association between 14-3-3 proteins and hyperphosphorylated tau in Alzheimer′s disease brains[J].Chinese Journal of Neurology,2005,38(10):620-623.DOI:10.3760/j.issn:1006-7876.2005.10.006.

[5]王慧,孔立红,李威,等.不同频率电针对阿尔茨海默病大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响研究[J].中医药学报,2015,43(5):20-23. WANG H,KONG L H,LI W,et al.Effects of electroacupuncture at different frequency on synaptic morphology plasticity of hippocampal neurons in Alzheimer′s disease rats[J].Acta Chinese Medicine and Pharmacology,2015,43(5):20-23.

[6]GRUNDKE-IQBAL I,IQBAL K,QUINLAN M,et al.Microtubule-associated protein tau.A component of Alzheimer paired helical filaments[J].J Biol Chem,1986,261(13):6084-6089.

[7]王建枝,田青.Tau蛋白过度磷酸化机制及其在阿尔茨海默病神经元变性中的作用[J].生物化学与生物物理进展,2012,39(8):771-777.DOI:10.3724/SP.J.1206.2012.00333. WANG J Z,TIAN Q.Molecular mechanisms underlie alzheimer-like Tau hyperphosphorylation and neurodegeneration[J].Progress in Biochemistry and Biophysics,2012,39(8):771-777.DOI:10.3724/SP.J.1206.2012.00333.

[8]MANCZAK M,REDDY P H.Abnormal interaction of oligomeric amyloid-beta with phosphorylated tau:implications to synaptic dysfunction and neuronal damage[J].J Alzheimers Dis,2013,36(2):285-295.DOI:10.3233/JAD-130275.

[9]夏亦元.14-3-3蛋白在阿尔茨海默病SET核运输中的作用及其分子机制研究[D].武汉：华中科技大学,2014. XIA Y Y.Effect of 14-3-3 on SET nuclear transportation and its molecular mechanism in alzheimer disease[D].Wuhan:Huazhong University of Science and Technology,2014.

[10]王慧.不同频率电针对阿尔茨海默病大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响研究[D].武汉：湖北中医药大学,2015. WANG H.Study of different frequency electroacupuncture effects on rat synaptic plasticity of hippocampal neurons in Alzheimer′s disease[D].Wuhan:Hubei University of Chinese Medicine,2015.

[11]李威.不同频率电针对阿尔茨海默病大鼠突触传递功能影响的研究[D].武汉：湖北中医药大学,2015. LI W.A study on the different frequency electro-acupuncture effects of AD rats by oligomeric Aβ1-42on hippocampal synaptic transfer function[D].Wuhan:Hubei University of Chinese Medicine,2015.

[12] 王小月,周丽莎.电针对AD模型大鼠海马神经干细胞bFGF及学习记忆能力的影响[J].湖北中医学院学报,2008,10(1):12-14.DOI:10.3969/j.issn.1008-987X.2008.01.005. WANG X Y,ZHOU L S.Effects of electroacupuncture on bFGF of AD model rat′s hippocampal neural stem sells and study memory ability[J].Journal of Hubei College of Chinese Medicine,2008,10(1):12-14.DOI:10.3969/j.issn.1008-987X.2008.01.005.

[13]薛卫国,葛桂玲,张忠,等.电针对转基因阿尔茨海默病小鼠海马CA1区超微结构的影响[J].针刺研究,2009,34(5):309-314. XUE W G,GE G L,ZHANG Z,et al.Effect of electroacupuncture on the behavior and hippocampal ultrastructure in APP 695 V 717 I transgenic mice[J].Acupuncture Research,2009,34(5):309-314.

[14] 吴羽楠,陈吉祥,陶静,等.电针百会对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力及Tau蛋白磷酸化的影响[J].中国康复医学杂志,2015,30(5):432-436.DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2015.05.005. WU Y N,CHEN J X,TAO J,et al.Effects of electroacupuncture at Baihui on learning and memory ability and Tau phosphorylation in APP/PS1 transgenic mice[J].Chinese Journal of Rehabilitation Medicine,2015,30(5):432-436.DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2015.05.005.

[15]肖贻财,吴新贵,周元成,等.不同电针频率对脑缺血大鼠脑星形胶质细胞的影响[J].广西中医药,2011,34(1):52-54.DOI: 10.3969/j.issn.1001-1242.2015.05.005. XIAO Y C,WU X G,ZHOU Y C,et al.Effect research of different frequencies electro-acupuncture on brain astrocytes in rats with focal cerebral ischemia[J].Guangxi Journal of Traditional Chinese Medicine,2011,34(1): 52-54.DOI: 10.3969/j.issn.1003-0719.2011.01.027.

[16]张亢亢,孔立红,王颖,等.不同频率电针对AD大鼠海马CA1区突触素和PSD-95表达的影响[J].李时珍国医国药,2016,27(10): 2539-2542.DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805.2016.10.085. ZHANG K K,KONG L H,WANG Y,et al.Effects of electro-acupuncture of different frequency on the SYN protein and PSD-95 protein expression of rats with Alzheimer’s disease[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2016,27(10): 2539-2542.DOI: 10.3969/j.issn.1008-0805.2016.10.085.

(本文编辑：毛亚敏)

Mechanism of Different Frequencies of Electroacupuncture in Treating Neuropathy in Rats with Alzheimer′s Disease

GAOShan,KONGLi-hong*,YUChao-chao,YAOGuo-jin

HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430000，China

*Correspondingauthor:KONGLi-hong，Professor；E-mail:xiyu1618@sina.com

Objective To explore the mechanism of different frequencies of eletroacupuncture in the treatment of neuropathy in Alzheimer′s disease(AD) rats,so as to provide a theoretical basis for clinical treatment of AD with electroacupuncture.Methods This study was conducted between March and June 2016.Ninety healthy male Wistar rats(SPF) were selected and qualified rats were screened by Morris water maze after 1 week of adaptive feeding.Then the qualified rats were divided into normal group,sham operation group,model group,2 Hz,30 Hz and 50 Hz electroacupuncture treatment groups according to the random number table method with 15 in each.The normal group was not given any treatment.The AD rats were established by injecting Aβ1-42oligomer into the lateral cerebral ventricle in model group,2 Hz,30 Hz and 50 Hz electroacupuncture treatment groups,whereas the rats in the sham operation group were constructed with 0.9% sodium chloride solution.And the success of modeling was confirmed by Morris water maze test again.After that,the rats in 2 Hz electroacupuncture treatment group were treated by G6805-Ⅱtype electroacupuncture instrument stimulation at Baihui and Shenshu acupoints with the frequency of 2 Hz.The rats in the 30 Hz and 50 Hz electroacupuncture treatment groups received the same treatment with the same parameters and operations as the 2 Hz electroacupuncture treatment group received except for electroacupuncture frequencies,30 Hz was selected for the 30 Hz electroacupuncture treatment group,and 50 Hz for the 50 Hz electroacupuncture treatment group.The rats in normal group,model group and sham operation group were grabbed in the same way as those rats in the electroacupuncture treatment groups but were put back without any treatment.The rats were sacrificed after intervention and samples of brain hippocampus,cortical tissues were collected.The expression levels of Tau protein,levels of phosphorylated Tau protein at serine 262,369,404 sites〔Tau(pS262),Tau(pS396),Tau(pS404)〕,14-3-3ζ and AMPA receptor protein in hippocampus and cortical tissue of rats were detected by Western blotting.Results Compared with the normal group,the expression levels of Tau protein in hippocampus tissue of AD rats in model group significantly decreased(P<0.05),whereas the levels of Tau(pS262) and Tau(pS396) increased obviously(P<0.05).The 50 Hz electroacupuncture treatment group had higher expression level of Tau protein but lower expression levels of Tau(pS262) and Tau(pS396) in the hippocampus tissue than model group,2 Hz and 30 Hz electroacupuncture treatment groups(P<0.05).Compared with the normal group,the model group had lower expression level of Tau protein and higher expression levels of Tau(pS262) and Tau(pS404) in the cerebral cortex(P<0.05).The 50 Hz electroacupuncture treatment group had higher expression level of Tau protein whereas lower expression level of Tau(pS404) in the cerebral cortex than the model group,2 Hz and 30 Hz electroacupuncture treatment groups(P<0.05).The expression levels of 14-3-3ζ in the hippocampus and cortex of the model group were higher than those in the normal group,whereas the expression level of AMPA receptor protein in hippocampus was lower than that in the normal group(P<0.05).The 50 Hz electroacupuncture treatment group had lower expression levels of 14-3-3ζ in hippocampus and cortex but higher expression level of AMPA receptor protein in hippocampus than the model group,2 Hz and 30 Hz electroacupuncture treatment groups(P<0.05).Conclusion Different frequencies of electroacupuncture treatment probably improved the neuropathy of AD rats by regulating the expression levels of Tau protein and phosphorylated Tau protein and related proteins(14-3-3ζ and AMPA),and thus achieved the effect of the treatment of AD.

Alzheimer′s disease；Electroacupuncture；Tau proteins

国家自然科学基金资助项目(81373741)——电针不同频率调控糖原合酶激酶3β对阿尔滋海默大鼠神经突触可塑性影响及机制的研究

R 745.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.009

2017-01-12；

2017-03-09)

430000湖北省武汉市，湖北中医药大学

*通信作者：孔立红，教授；E-mail:xiyu1618@sina.com