高效液相色谱法测定参麦散结胶囊中羟基红花黄色素A的含量

袁常珍，梅 刚

(1.泸州市食品药品检验所中药室，四川 泸州 646000； 2.四川省泸县中医医院药剂科，四川 泸州 646000)

高效液相色谱法测定参麦散结胶囊中羟基红花黄色素A的含量

袁常珍1*，梅 刚2

(1.泸州市食品药品检验所中药室，四川 泸州 646000； 2.四川省泸县中医医院药剂科，四川 泸州 646000)

目的：建立高效液相色谱法测定参麦散结胶囊主药红花中羟基红花黄色素A的含量。方法：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(V∶V∶V=23 ∶2 ∶75)，检测波长为403 nm，流速为1.0 ml/min，柱温为35 ℃。结果：羟基红花黄色素A的质量浓度在24.25～121.25 μg/ml范围内具有良好的线性关系(r=0.999 5，n=5)，平均回收率为97.93%，RSD为1.64%(n=6)。结论：本方法简便快速、准确、重复性好，可用于该制剂的质量控制。

高效液相色谱法； 参麦散结胶囊； 羟基红花黄色素A； 含量测定

参麦散结胶囊是由党参、麦冬、酸枣仁、红花等9味中药制成的中药复方制剂，由泸州医学院(即西南医科大学附属医院)制剂室生产，具有益气养阴、软坚散结、活血化瘀等功效，适用于颈部包块、心悸自汗、神疲乏力、气短等甲状腺肿大见上述症状者，其疗效显著，在临床应用广泛。红花具有活血通经、散瘀止痛的功效，其主要成分为羟基红花黄色素A、山萘素等[1-2]。现选取羟基红花黄色素A的含量作为参麦散结胶囊质量控制的指标，采用高效液相色谱法进行测定，报告如下。

1 材料

1.1 仪器

Angilent 1200型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；LC 3D系统化学工作站(版权：安捷伦科技有限公司2001—2007)；安捷伦G1329A型液相色谱进样器；XS205DU型电子天平(梅特勒-托利多)；KH7200B型超声清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

羟基红花黄色素A(中国食品药品检定研究院，批号：111637—201308)；参麦散结胶囊(泸州医学院附属医院，批准文号：川药制字Z20070523，批号：160601、160701、160728，规格：0.45 g/粒)；甲醇为色谱纯(美国Fisher Scientific)，乙腈为色谱纯(美国Fisher Scientific)，水为重蒸馏水，磷酸为分析纯(重庆川东化工集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温为35 ℃；流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(V∶V∶V=23 ∶2 ∶75)[3-6]；流速为1.0 ml/min；检测波长为403 nm[7-10]；进样量为15 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.2 供试品溶液：精密称取参麦散结胶囊中的内容物1 g，置于50 ml容量瓶中，加入30%甲醇适量，超声30 min(功率300 W，频率50 kHz，冰袋控温)[1，3，11-12]，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照品溶液：按处方比例计算，制成缺红花的阴性样品100粒，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下对照品贮备溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各15 μl，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。结果显示，对照品溶液与供试品溶液主成分峰的保留时间基本一致，供试品溶液主成分峰与杂质峰分离良好，阴性对照无干扰，理论板数以羟基红花黄色素A峰计算>3 000。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液A. reference solution; B. test solution; C. negative reference solution图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下对照品贮备溶液1、2、3、4、5 ml，置于10 ml容量瓶中，以30%甲醇溶液定容至刻度[1，7，12-14]，摇匀。分别精密量取上述溶液15 μl，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以羟基红花黄素A峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=16.937 5X-12(r=0.999 5，n=5)。结果表明，羟基红花黄色素A质量浓度在24.25～121.25 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。采用Kolmogorov-Smimov检验考察数据是否符合正态分布，采用Levene检验考察数据的方差齐性。符合正态分布且方差齐的计量资料以x±s表示，采用t检验；计数资料以例数或率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

精密量取“2.2.1”项下对照品贮备溶液3 ml，置于10 ml容量瓶中，加入30%甲醇溶液稀释至刻度，即得质量浓度为72.75 μg/ml的对照品溶液。精密量取上述对照品溶液15 μl，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果表明RSD=0.86%(n=6)，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液，分别于室温(25 ℃)下放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h时进样测定[12-13，15]，进样量15 μl，记录峰面积。结果表明RSD=1.02%(n=8)，供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的样品1 g，共3份，置于50 ml容量瓶中，分别精密加入“2.2.1”项下对照品贮备溶液10、15、25 ml，加30%甲醇溶液适量，超声处理30 min(功率300 W，频率50 kHz，冰袋控温)，并用30%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过。分别精密量取续滤液5 ml，置于10 ml容量瓶中，加入30%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果(n=6)Tab 1 Recovery test of hydroxysafflor yellow A(n=6)

2.8 重复性试验

精密称取同一批样品(批号：160728)适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，羟基红花黄色素A的平均含量为4.469 5 mg/g，RSD=0.85%(n=6)，本方法重复性良好。

2.9 样品含量测定

取各批样品适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算样品中羟基红花黄色素A的含量，见表2。

表2 羟基红花黄色素A含量测定结果Tab 2 Content determination of hydroxysafflor yellow A

3 讨论

3.1 色谱条件考察

参照《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)红花“含量测定”项下的色谱条件和测定方法对参麦散结胶囊中羟基红花黄色素A进行含量测定，根据品种自身特点，对流动相、提取溶剂、提取时间做部分调整后所得方法准确、快速、重现性好，可用于羟基红花黄色素A的含量测定。参考相关文献中采用甲醇磷酸系统作为流动相的方法[3]，本研究分别考察了甲醇-0.5%磷酸溶液(V∶V=25 ∶75)、甲醇-0.5%磷酸溶液(V∶V=20 ∶80)、甲醇-0.5%磷酸溶液(V∶V=27 ∶73)、甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(V∶V∶V=26 ∶2 ∶72)作为流动相。结果表明，甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(V∶V∶V=23 ∶2 ∶75)作为流动相时保留时间适宜，分离效果、对称性、重复性、理论板数较好。并分别考察了柱温35、30、25 ℃时，流速1.5、1.2、1.0、0.9、0.8 ml/min时的结果，最终确定了柱温为35 ℃、流速为1.0 ml/min的色谱条件。

3.2 提取时间考察

由于羟基红花黄色素A的热不稳定性，本研究采用超声法提取样品。在相同的试验条件下，考察了样品在超声20、30、35、40、45、50 min后的提取效果。结果表明，样品在超声30 min时提取率最高，损失最小。而随着超声时间延长，可能导致水温升高，羟基红花黄色素A含量下降，故在超声过程中，可用冰袋控温。

3.3 提取溶剂考察

在相同实验条件下，本研究分别考察了流动相及100%、75%、50%、30%、25%的甲醇溶液作为提取溶剂时的提取率。结果表明，选择30%甲醇溶液时的提取率最高，故选用30%甲醇溶液作为提取溶剂。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：151.

[2]梁颖，裴瑾，万德光.红花黄色素中主要成分的含量测定[J].中国现代应用药学，2011，28(13)：1349-1351.

[3]陈宗良，朱克，周玲娜，等.HPLC法测定愈伤灵胶囊中羟基红花黄色素A的含量[J].药物分析杂志，2010，30(2)：297-299.

[4]江建君，李玲玲，陈惠玲，等.HPLC法测定正天丸和正天胶囊中羟基红花黄色素A的含量[J].中国药品标准，2013，14(3)：197-200.

[5]孙瑛，何春龙，王焕芸.HPLC法测定五味清浊丸中羟基红花黄色素A的含量[J].现代中药研究与实践，2015，29(1)：58-60.

[6]黎跃成.HPLC法测定肤痒颗粒中羟基红花黄色素A的含量[C]//第十届全国药用植物及植物药学术研讨会论文摘要集，2011：178.

[7]赵明波，邓秀兰，王亚玲，等.高效液相色谱法测定红花中羟基红花黄色素A[J].色谱，2003，21(6)：593-595.

[8]赵国英，袁秀荣，李玲，等.鹿红颗粒中黄芪甲苷和羟基红花黄色素A的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(6)：40-43.

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[10] 邹婕凡，周萍，鲁翠香.HPLC法测定丹红注射液中羟基红花黄色素A的含量[J].现代医药卫生，2013，2(5)：658-659.

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[15] 喻录容，何先元，黄英如.HPLC同时测定冠心康颗粒中芍药苷、丹酚酸B和羟基红花黄色素A的含量[J].中国现代应用药学，2015，32(5)：561-564.

Content Determination of Hydroxysafflor Yellow A in Shenmaisanjie Capsules by HPLC

YUAN Changzhen1, MEI Gang2

(1.Traditional Chinese Medicine Laboratory，Luzhou Food and Durg Inspection Institute, Sichuan Luzhou 646000, China; 2.Dept.of Pharmacy, Sichuan Luxian County Traditional Chinese Medicine Hospital, Sichuan Luzhou 646000, China)

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of hydroxysafflor yellow A in Shenmaisanjie capsules by high performance liquid chromatography(HPLC). METHODS： The chromatographic column was ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phases consist of methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid(V∶V∶V=23 ∶2 ∶75), with detective wavelength of 403 nm and flow rate of 1.0 ml/min, the column temperature was 35 ℃. RESULTS： The calibration curve of hydroxysafflor yellow A was linear over the range of 24.25 μg/ml-121.25 μg/ml(r=0.999 5，n=5). The average recovery rate was 97.93%,RSD=1.64%(n=6). CONCLUSIONS： The method is simple, rapid and accurate with good reproducibility and can be used for the quality control of the preparation.

High performance liquid chromatography; Shenmaisanjie capsules; Hydroxysafflor yellow A; Content Determination

R927.2

A

1672-2124(2017)03-0377-03

2016-11-25)

*主管中药师。研究方向：药品检验。E-mail：270414608@qq.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.03.033