用酶联免疫试剂盒检测鸡肉中的四环素类抗生素

赵敬翠

四环素类抗生素能促进幼畜禽的快速生长，具有促生长作用，有些养殖户受利益驱动，在动物的饲料、饮水中过量添加，造成畜产品中抗生素残留。如果长期食用该药残的畜产品，会使人肌肉酸痛、肝肾损坏、骨骼生长发育受阻及易患四环素牙。因此，国家规定通过酶联免疫法检测鸡肉中四环素类抗生素为不得检出。

目前酶联免疫吸附法是我们县区最常用的检测方法。本文用酶联免疫试剂盒检测鸡肉中四环素类抗生素的含量，其原理是待测样品中的四环素类药物与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，当样品中四环素类药物含量少时，更多的抗体就会与酶标板上的抗原结合而被固定在酶标板上，加入酶标记物，催化底物显色，颜色为深蓝色；反之，含量多时，颜色为浅蓝色。

一、实验材料

样品前处理：随机抽取代表性样品（鸡肉）40批次，每个样品取鸡腿部肌肉，精确秤取1±0.01g，均质后的样品于50mL离心管中，充分涡动1min，4000g以上离心10min，立即取50uL上清液进行检测。

试剂盒：四环素类酶联免疫试剂盒（96孔）。北京维德维康生物技术有限公司生产。

试剂盒回温：试剂盒内各组份放于室内恢复至室温23-27℃。

添加阳性对照：根据标准曲线确定阳性对照浓度为6ppb，取浓度12.15ppb标准品494.0μL添加到1g空白样品中，成为浓度6ppb的阳性对照品，用于计算阳性对照回收率。前处理同前。

二、检测步骤

取出酶标板，做双孔平行，记录标准品、阳性对照品和样品的位置。

在标准品孔内依次加入标准品工作液（0、0.15、0.45、1.35、4.05、12.15ppb）50μL，在样品孔内依次加入阳性对照品、阴性对照品和其它待测样品均为50μL。添加不同样品时需更换枪头，防止交叉污染。

每孔加入50μL酶标记物工作液，再每孔加入50μL抗体工作液。

用盖板膜盖好酶标板，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温（23-27℃）下避光反应30min。

揭开盖板膜，倒掉孔中的液体，在每孔中加入260μL洗涤工作液（1份浓缩洗涤液加19份去离子水），洗涤4次，每次浸泡15-30s。最后一次清洗后，倒掉孔中洗液，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干。（在亮光处观察孔底是否有气泡，气泡可用干净的枪头戳破，戳不同孔底的气泡应更换枪头）

立即在每孔中加入100μL底物A、B混合液（按1：1比例充分混合，必须在5min内使用，不能使用金属盛装、搅拌试剂）。

用盖板膜盖好酶标板，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温（23-27℃）下避光反应15-20min。

揭开盖板膜，每孔中加入50μL终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀。

终止后5min内，将酶标板放在酶标仪的载板架上，用酶标仪在双波长450nm、630 nm下读取酶标板吸光度值，并將数值打印出来。

三、计算阳性对照回收率

利用电脑上r-biopharm数据分析软件，把测得的数值录入，软件自动对结果进行分析，同时绘制标准曲线并得出所有检测样品中四环素类抗生素的含量。回收率（%）=（实测阳性对照浓度—实测阴性对照浓度）÷添加浓度（6ppb）×100%，本次检测回收率为95%，在75-105%范围内，说明此次检测和结果准确性高。

四、结语

试剂盒贮存于2-8℃环境中，抗体和酶标Ⅱ抗在常温下容易变性。

加样时移液枪应垂直于板孔，防止将液体加在孔壁上部；加等量同种试剂时应用多道移液枪，提高速度，节省操作时间，减少实验误差。

实验中的保温避光反应步骤，是抗原抗体反应的完成过程，需要有一定的时间和温度。因为抗原与抗体结合的机会不均等，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触，这是一个逐步平衡的过程。

洗板是很关键的一步。主要靠洗涤使游离的与结合的酶标记物的达到分离目的，通过洗涤清除残留在板孔中没结合的物质。如果洗涤次数不够、注入的洗涤液量不足或洗板间隔太久会直接影响检测的结果，甚至使实验失败。

检测药物残留的常用方法有：高效液相色谱法、气质联机法和酶联免疫吸附法。目前我们常用的是酶联免疫法，具有方便、快速、灵敏等特点，适用于大批量样品筛查。