A抗原减弱表型的基因分析*

马晓莉，马宏伟#，金新莉，杨贺才，陈 赞

1)河南省红十字血液中心血型室 郑州 450000 2)河南省红十字血液中心检验科 郑州 450000 3)河南省红十字血液中心科研外事科 郑州 450000

A抗原减弱表型的基因分析*

马晓莉1)，马宏伟1)#，金新莉2)，杨贺才3)，陈 赞1)

1)河南省红十字血液中心血型室 郑州 450000 2)河南省红十字血液中心检验科 郑州 450000 3)河南省红十字血液中心科研外事科 郑州 450000

#通信作者，男，1972年10月生，硕士，主任技师，研究方向：输血免疫，E-mail：mubel666@163.com

抗原减弱；ABO血型；基因分析

目的：研究A抗原减弱的分子遗传学背景。方法：用血清学的方法筛选出2015年1月至11月A抗原减弱的样本6例，对其ABO基因的第6、7外显子进行测序分析。结果：6例中基因型为A102/O01有2例，A102/O02有1例，A102/B101有2例，1例样本发现新的等位基因。结论：由于ABO基因的多态性，除了常见的第6、7外显子上的基因突变引起抗原减弱外，第6、7外显子以外的基因变异或转录结构以及调控区域的异常都有可能导致A抗原减弱。

ABO血型自发现以来一直在临床输血及器官移植中占据着重要地位。按照抗原类型的不同可以分为A、B、O、AB四种血型，然而在临床实践中有时会遇到A抗原表达减弱甚至不表达的样本，干扰了血清学的鉴定。造成这种现象的原因除了有常见的新生儿和疾病引起的抗原减弱外，还有一类较罕见的由遗传方面引起的抗原表达减弱。作者收集了6例具有该特征的样本，并对其进行了血清学检测和ABO基因测序，旨在进一步了解A抗原减弱表型的分子遗传学机制。

1 材料与方法

1.1 样本收集 用血清学方法对2015年1月至11月期间郑州市无偿献血者进行检测，将A抗原凝集强度反应为2+以下的定义为抗原减弱，共6例。其中男性2例，女性4例，年龄在18～55岁。

1.2 试剂与仪器 抗A抗体、抗B抗体及ABO标准红细胞(美国Immucro公司)，单特异性/多特异性抗人球蛋白试剂、抗H抗体(上海市血液生物医药有限责任公司)，基因组DNA提取试剂盒(美国TBG公司)，Taq 酶(Promega公司)，PCR扩增仪9700(美国ABI公司)，测序仪3130x(美国ABI公司)。

1.3 ABO血型的血清学检测 用抗A抗体、抗B抗体做正定型， A细胞、B细胞、O细胞做反定型，并做抗H抗体和吸收放散实验。盐水凝集试管法、吸收放散实验均按《全国临床检验操作规程》(第4版)进行操作。

1.4 ABO血型的基因测序

1.4.1 DNA的提取 采集3～5 mL外周血，用EDTA抗凝，按试剂说明书提取样本DNA用于扩增和测序分析。

1.4.2 ABO基因第6、7外显子PCR扩增 引物以ABO基因序列为模板设计， 第6外显子引物序列为5’-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3’和5’-ATGTCCA CAGTCACTCGCCA-3’； 第7外显子引物序列为5’-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3’和5’-GTTTACCCGT TCTGCTAA-3’。 引物由天津市秀鹏生物技术开发有限公司合成。PCR反应体系包括：dNTP 400 μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，10×PCR缓冲液5 μL，Taq酶0.5 U，模板DNA 500 ng，引物10 pmol/L，终反应体系50 μL。循环参数：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共30个循环；后72 ℃ 10 min。

1.4.3 ABO基因第6、7外显子序列分析 采用直接测序的方法，用Chromas2.01软件阅读测序图谱，以A101序列作为标准序列，使用DANMAN5.22进行序列比对。

2 结果

2.1 血清学鉴定结果 见表1。

表1 6例样本的血清学和基因测序结果

+：有反应；-：无反应；mf：混合视野；s：强度以上；w：强度以下。

2.2 基因测序判定结果 经测序6例样本的基因型分别为：A102/O01有2例，A102/O02有1例， A102/B101有2例， 1例样本发现新的等位基因。新基因综合结果判定见表2，突变部位见图1。

表2 新基因综合结果判定(以A101为标准序列)

Ins G：为碱基插入。图1 新基因突变测序图

3 讨论

ABO基因存在A、B、O 三个等位基因，该基因并不直接产生抗原，而是产生特异性糖基转移酶，这些酶控制着ABO血型抗原的生成[1]。ABO血型抗原的弱表达主要原因是在ABO基因编码区发生错义突变[2]。ABO基因有7个外显子，在基因组上DNA超过18 kb，外显子大小28～688 bp，第6和7外显子占全部编码序列的77%，编码91%的酶催化区域，目前报道的ABO等位基因的点突变大多发生在该区域[3]。所以该实验对第6和第7外显子的序列进行了测序分析。结果显示，1例献血者的ABO基因其他突变点具有A102/O02特点，但第7外显子发生817 Ins G，经查询NCBI未收录该突变，应为原生突变。由于Ins G的发生导致T→G，引起第273位丝氨酸替换为丙氨酸，致其下游氨基酸链发生改变，造成糖基转移酶的空间结构发生变化，使糖基转移酶的能力发生改变，最终表现为A抗原的减弱。

A102在中国人群的比例相当高，是常见的基因型，有文献报道，北京地区A102频率为20.20%[4]，福州地区为36.49%[5]。A102与A101在分子层面相比，发生467位的单个碱基替换(C→T)，导致氨基酸Pro→Leu替换，两者翻译糖基转移酶的活力没有明显差异。而作者的血清学实验发现：5例基因型为A102的样本中，有4例样本盐水法检测不出A抗原，只有通过吸收放散实验才能检出，且强度普遍偏弱；剩下的1例强度也在中等以下；据此5例样本都判断为A亚型。但血清学实验容易受年龄、温度等因素的干扰，可能会引起抗原凝集的减弱，虽然5例判为ABO亚型，但通过基因检测技术确定了上述样本为ABO常见型。由于实验只进行了第6、7外显子的测序，所以引起抗原减弱的原因也可能与第6、7外显子以外的突变、转录及调控区域的异常等方面有关。这个观点近年来也有研究验证，如喻琼等[2]报道ABO基因启动子区CpG岛甲基化可引起抗原弱表达，金飞[6]报道抗原的减弱与糖基转移酶的活性减弱有关。所以进一步研究这些领域的分子机制将有助于理解有相同等位基因的个体却产生不同的血清学表现。

综上所述，基因技术可以弥补血清学方法的不足，而血清学实验有着方便快捷直观的优势，所以两种方法不可相互替代，在实际操作中应相结合互为补充，以便准确地判断ABO血型，保障临床用血安全。由于ABO基因的多态性，除了常见的第6、7外显子上的基因突变引起抗原减弱外， 第6、7外显子以外的基因变异或转录结构以及调控区域的异常都有可能导致A抗原减弱。今后作者将继续积累样本，进一步研究导致A抗原减弱的分子调控机制。

[1]张嵘，苏品璨，田力，等. 昆明地区无偿献血者ABO亚型的分子遗传学分析[J].中国输血杂志，2012，25(3)：219

[2]喻琼，苏宇清，甄建新，等. B弱亚型表达调控的分子机制研究[J].国际输血及血液学杂志,2013,36(3):220

[3]池泉，张爱，任本春.B抗原减弱表型的表型频率与ABO基因分析[J].检验医学，2013,28(12):1128

[4]刘长利，龚晓燕，王卓妍，等. 北京地区汉族人群AB0血型基因分型研究[J].中国实验血液学杂志,2008,16(2):425

[5]黄文华，卓孝福，林海娟，等. 福州地区汉族人群ABO血型系统基因型研究[J]. 国际输血及血液学杂志,2014,31(1):16

[6]金飞.ABO血型变异与B糖基转移酶关系研究[J]. 检验医学与临床，2014,11(1):28

(2016-10-10收稿 责任编辑赵秋民)

Gene analysis of A antigen weakened phenotype

MAXiaoli1)，MAHongwei1)，JINXinli2)，YANGHecai3)，CHENZan1)

1)BloodTypeResearchLaboratory，HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450000 2)ClinicalLaboratory，HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450000 3)DepartmentofInternationalOffice-ResearchDevelopment，HenanRedCrossBloodCenter，Zhengzhou450000

antigen weakened; ABO blood type; gene analysis

Aim: To study the molecular genetic background of A antigen weakening by serologically detecting the A antigen weakened phenotype samples and ABO gene sequencing. Methods: Serological method was used to screen A antigen weakened samples blood donors of from during January 2015 to November 2015. The exons 6 and 7 of the ABO gene were amplified by PCR and sequenced. Results: There were 6 cases with A-antigen-attenuated type and their genotypes were A102/O01(2 cases), A102/O02(1 case), A102/B101(2 cases), and a new allele(1 case). Conclusion: Because of the ABO gene polymorphism, in addition to the the mutations in exons 6 and 7, other gene mutation or transcriptional structure as well as abnormalities of regulation region are likely to lead to A antigen weakening.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.021

*河南省医学科技攻关项目 201503199

R392.7