枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶在大肠杆菌中的诱导及组成型表达

朱 颖，马晓强，杨胜利，魏东芝，苏二正,2

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所，上海200237；2.南京林业大学轻工科学与工程学院酶与发酵工程实验室，南京210037)



枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶在大肠杆菌中的诱导及组成型表达

朱 颖1，马晓强1，杨胜利1，魏东芝1，苏二正1,2

(1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所，上海200237；2.南京林业大学轻工科学与工程学院酶与发酵工程实验室，南京210037)

本研究构建了8种诱导型质粒和16种组成型质粒，试图实现枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶(CAH)基因在大肠杆菌中的高效异源表达。经过筛选，最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL3基因、trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒pB1-SIL3-K为最佳表达质粒。将PB1-SIL3-K转入EscherichiacoliDH5α，重组菌在37 ℃发酵培养24 h，其OD值达到5.4，酶活达到了138.61 U/mL。进一步通过培养基组成、培养条件、放大过程等优化，在7 L发酵罐上，CAH最高酶活达到1 340 U/mL，为目前国内外文献报道最高水平。

头孢菌素C脱乙酰基酯酶；诱导型表达；组成型表达；3′-脱乙酰基-7-氨基头孢烷酸

头孢菌素类抗生素是抗生素家族的一个重要分支，它与青霉素同属β内酰胺类抗生素，具有较低的毒性、广泛的抗菌谱、高效的抗菌作用等优点。7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是头孢菌素类抗生素的重要中间体，对其结构进行改造可以合成一系列的头孢菌素C(CPC)衍生物。当前，以7-ACA为中间体半合成的头孢菌素类抗生素已发展到了第四代，其抗菌活性变得更强，抗菌谱也变得更加广泛。

脱去7-ACA的3′位上的乙酰基后得到的带有裸露羟基的化合物为3′-脱乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)，是一种新型的头孢菌素类抗生素中间体。由于7-ACA的3′位是酯基，半合成时不易反应，而D-7-ACA 的3′位是裸露的羟基，反应活性高，易受到亲核试剂的进攻，因此方便转化，可以添加不同的官能团从而得到不同类型的头孢类衍生物。所以，对第二、三、四代以及将要到来的第五代头孢菌素类抗生素的生产来说，D-7-ACA的开发是一种新的选择。

D-7-ACA的制备方法分为化学法与酶法。化学法一般在-40～-30 ℃下，加入高浓度的强碱对7-ACA进行水解，从而得到D-7-ACA。这种方法能耗高、成本高，得到的D-7-ACA产品含有较多杂质且底物的损失近20%～30%，所以导致收率也较低。而酶法可以避免化学法的上述缺点。酶法分为两步酶法与一步酶法：两步酶法是以脱乙酰基头孢菌素C(D-CPC)为原料，用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA酰化酶)两步水解制备D-7-ACA。一步酶法可以D-CPC作为底物，在固定化CPC酰化酶的作用下，一步水解制备D-7-ACA；也可以7-ACA为原料，在固定化脱乙酰基酯酶的作用下，一步水解制备D-7-ACA。不论是两步酶法还是一步酶法，乙酰基的脱除都需要固定化脱乙酰基酯酶的催化水解。

脱乙酰基酯酶(EC3.1.1.41，cephalosporin-C deacetylase(CAH))是酯酶的一种，广泛存在于许多生物体中，例如柑桔皮、放射土壤农杆菌[7-8]、真菌[9-10]、枯草芽孢杆菌[11-14]、红冬孢酵母[15]、黏红酵母[16]中。在有水的环境里，它可以催化CPC与7-ACA酯键的水解，从而脱去乙酰基变成D-CPC与D-7-ACA,同时生成乙酸。根据文献[11-14]报道，来源于枯草芽孢杆菌的CAH具有良好的催化性能和稳定性，对底物7-ACA和CPC的亲和力高，是制备D-7-ACA的最佳CAH。

本文中，笔者尝试将不同枯草芽孢杆菌来源的CAH在大肠杆菌中进行诱导及组成型表达，以期获得高表达CAH的重组大肠杆菌工程菌，为CAH高效、低成本发酵制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

枯草芽孢杆菌1.107购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,枯草芽孢杆菌XSA12、YIS和SIL3保藏于华东理工大学鲁华生物技术研究所；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、JM109，质粒pMD19-T、pET-24a、pET-28a、pUC 19、pKK 233-2保藏于生物反应器工程国家重点实验室。

1.1.2 工具酶、试剂及药品

限制性内切酶NdeI、XhoI、BstEII、PstI、HindIII、NdeI、BamHI与T4 DNA连接酶，Fermentas公司；DNA Marker DL2000、DL5000、DL10000以及PCR用的Premix Taq DNA 聚合酶、Prime STAR HS DNA聚合酶，TaKaRa公司；细菌基因组DNA小量提取试剂盒，北京庄盟国际生物公司；质粒DNA小量制备试剂盒与DNA凝胶回收试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司；酵母浸出粉和胰蛋白胨，OXOID公司。其他试剂药品均为市售分析纯。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏0.5 g/L；115 ℃湿热灭菌20 min，用于枯草芽孢杆菌的培养。

LB液体培养基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L；121 ℃湿热灭菌15 min。

LB固体培养基：LB液体培养基内加入15 g/L的琼脂粉；121 ℃湿热灭菌15 min。

M9培养基:葡萄糖10 g/L，安琪酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L； 115 ℃湿热灭菌20 min，加入已灭菌的M9基础盐(上海容创生物技术有限公司)。

氨苄青霉素：配制质量浓度为100 mg/mL，滤膜无菌过滤后分装到1.5 mL离心管内，-20 ℃冷冻保藏。使用终质量浓度为50 μg/mL。

卡那霉素：配制质量浓度为100 mg/mL，滤膜无菌过滤后分装到1.5 mL离心管内，-20 ℃冷冻保藏。使用终质量浓度为25 μg/mL。

1.1.4 引物

本研究所用引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.2 实验方法

基因组提取、质粒提取、酶切、连接、大肠杆菌转化、核酸电泳分析、SDS-PAGE蛋白分析等操作均参照文献`[17]方法。

1.2.1 CAH基因的克隆

根据已知的来源于枯草芽孢杆菌的脱乙酰基酯酶的保守序列，设计引物CAH-NdeI和CAH-XhoI，分别以枯草芽孢杆菌1.107、XSA12、YIS和SIL3的基因组作为模板，通过PCR扩增获得4个枯草芽孢杆菌的CAH基因。PCR扩增程序：94 ℃预热10 min后，以94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min作为一个循环，进行30个循环后，在72 ℃延伸10 min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳回收后，与pMD19-T质粒连接，并转入E.coliDH5α，在含氨苄抗性的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16 h。挑选菌落进行菌落PCR,将通过PCR结果筛选出来的阳性菌保种并送至华大基因公司进行DNA测序。

1.2.2 CAH诱导型表达菌株的构建、表达、纯化及动力学参数测定

诱导型菌株构建：将经过测序鉴定的克隆菌株E.coliDH5α接种于含有氨苄抗性的新鲜液体LB培养基内，37 ℃过夜培养12 h后，收集菌体提取质粒DNA。将含有酯酶基因的pMD19-T质粒进行NdeI与XhoI双酶切，与同时用NdeI与XhoI酶切处理过的表达质粒pET-24a、pET-28a进行连接，得到重组质粒pET24a-1.107、pET24a-XSA12、pET24a-YIS、 pET24a-SIL3和pET28a-1.107、pET28a-XSA12、pET28a-YIS、 pET28a-SIL3。重组质粒转化E.coliBL21感受态细胞，转化液均匀涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养16 h。挑选菌落进行菌落PCR,将通过PCR结果筛选出来的阳性菌保种并送至华大基因公司进行DNA测序。

重组CAH的表达：将验证过的诱导型工程菌株接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养16 h，取500 μL接种于50 mL含有卡那霉素的LB液体培养基内，37 ℃振荡培养2～3 h，至OD处于0.6～1.0之间，加入25 μL 1 moL/L的IPTG开始诱导培养。诱导培养的温度选择20 ℃，转速200 r/min，培养20 h。诱导培养结束后，收集菌体，用0.1 moL/L pH 8.0的磷酸钠缓冲液重悬菌体，超声破碎。破碎液在8 000 r/min转速下离心10 min，使上清酶液与细胞碎片和包涵体充分分离。上清液进行CAH酶活测定，纯化和动力学参数测定，同时，将上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。

CAH的纯化：上述上清液利用镍(Ni)柱进行亲和纯化。纯化好的酶液通过透析12 h除去咪唑等离子，保存待用。

动力学参数的测定：将透析好的CAH溶液稀释成同等蛋白浓度的纯酶溶液，用0.1 moL/L磷酸钠盐配制15 mmoL/L、pH 8.0的7-ACA和CPC溶液100 mL，稀释成浓度分别2、3、5、8、10和12 mmoL/L的底物溶液，按照测酶活的方法，加入等量体积的纯酶溶液，精确反应5 min。每个样品做3个平行，以0.1 moL/L、pH 8.0的磷酸钠盐缓冲液作为空白，高效液相色谱(HPLC)检测反应速率随着底物浓度的变化。根据液相测定结果制作Y(1/V)-X(1/cs)图，从而计算得到酶的Km值与最大反应速率Vmax。

1.2.3 CAH组成型表达菌株的构建与表达

组成型质粒构建：选择高拷贝的pUC 19质粒进行改造。首先，将pUC19的氨苄青霉素抗性替换为卡那霉素的抗性；然后，加入强终止子5S rrnT1T2，考察终止子的有无对菌株表达以及酶活的影响；利用重叠PCR技术，将trp启动子与CAH通过重叠PCR方法直接连接。同时在重叠区域设计不同的碱基组合，可以考察间隔序列碱基不同对菌种表达以及酶活的影响。

Kan抗性替代：以pUC 19-XhoI和pUC 19-BstEII为引物，pUC 19质粒为模板反向PCR扩增，去除其Amp基因部分，并引入了XhoI和BstEII两个酶切位点;同时以Kan-XhoI和Kan-BstEII为引物，以pET-28a质粒为模板，PCR扩增得到Kan抗性基因，并引入了XhoI和BstEII两个酶切位点。将上述两种PCR产物进行回收，纯化后用XhoI和BstEII在37 ℃酶切3 h，回收后进行连接，并转化到含有kan抗性的大肠杆菌E.coliDH5α，筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，将其命名为kan-19。

终止子加入：以Ter-PstI与Ter-HindIII为引物，pKK 233-2质粒为模板，PCR扩增得到强终止子5S rrnT1T2序列，回收后与之前提取的kan-19质粒同时进行PstI和HindIII双酶切，回收酶切产物，并进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliDH5α，菌落PCR筛选得到含有强终止子5S rrnT1T2序列阳性菌落，并提取质粒并命名为kan19-R。

CAH与trp启动子的重叠PCR：以T1-NdeI与T1-B1为引物，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到尾端带有序列B1的trp启动子；同样的，以T1-NdeI与T2-B2，大肠杆菌基因组为模板，PCR扩增得到尾端带有序列B2的trp启动子。以CAH-B1-T1与CAH-BamHI为引物，pET28a-1.107、pET28a-XSA12、pET28a-YIS和pET28a-SIL3为模板，扩增前端带有序列B1的1.107、XSA12、YIS、SIL34种酯酶基因。同理，以CAH-B2-T2与 CAH-BamHI为引物，pET28a-1.107、pET28a-XSA12、pET28a-YIS和pET28a-SIL3为模板，扩增前端带有序列B2的1.107、XSA12、YIS和SIL3这4种酯酶基因。以T1-NdeI与CAH-BamHI为引物，通过重叠PCR的方法，扩增得到带有间隔序列分别为B1和B2的trp启动子与4种基因组合的8个长片段，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后连接T载体并转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选阳性克隆后送至华大基因公司进行DNA测序，经验证正确后保种并提取质粒保存待用。

重叠片段与组成型质粒的连接：上述获得的包含有不同组合的8种重叠片段的T载体质粒与之前构建的kan-19与kan19-R两种组成型质粒同时用NdeI与BamHI酶切，连接转化大肠杆菌E.coliDH5α，筛选阳性克隆后送至华大基因公司进行DNA测序。最终构建获得了16种质粒。

转化不同的宿主：将上述16种质粒分别转化大肠杆菌E.coliJM109和E.coliDH5α，得到32株备选工程菌株。其中组成型菌株的表达使用M9培养基，在37 ℃培养24 h。

1.2.4 CAH酶活的测定

以7-ACA或CPC为底物测定脱乙酰酯酶酶活的方法：用0.1 moL/L、pH 8.0的磷酸钠缓冲液将底物7-ACA或CPC配成浓度为150 mmoL/L的溶液，取2 mL底物溶液加入到25 mL三角瓶内，放置于30 ℃水浴摇床内预热5 min，加入稀释好的酶液1 mL，反应开始。精确反应5 min，取200 μL反应液迅速加入到800 μL乙腈中，终止反应。用乙腈稀释10倍后，12 000 r/min离心10 min，取700 μL加入到液相小瓶中，用高效液相色谱法对5 min内产物D-7-ACA或D-CPC的生成量进行检测。流动相(体积分数)：15%甲醇、7.5%乙腈以及77.5%的1.29%乙酸溶液。使用反向柱 XDB C-8 column (Zorbax,4.6 mm×150 mm)，流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为30 ℃。在上述反应条件下，每分钟释放1 μmol D-7-ACA或D-CPC所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 4株枯草芽孢杆菌CAH的克隆

根据已知的来源于枯草芽孢杆菌的脱乙酰基酯酶基因序列，设计了扩增用的特异性引物CAH-NdeI与CAH-XhoI。以枯草芽孢杆菌1.107、XSA12、YIS和SIL3的基因组作为模板，进行PCR扩增反应，结果见图1。反应结束后，将PCR产物全部进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下进行电泳结果的观察与目的条带的切胶回收。由图1可知：4个样品泳道都在1 000 bp左右处出现清晰单一的条带，与已知的脱乙酰基酯酶基因(957 bp)大小相符，证明4株枯草芽孢杆菌的基因组中都含有脱乙酰酯酶的基因。

M为DL 5 000 Marker;1为CAH-1.107；2为CAH-XSA12；3为CAH-YIS； 4为CAH-SIL3图1 PCR获得脱乙酰基酯酶基因Fig.1 PCR product of CAH gene

对目的基因进行胶回收。回收纯化的片段与扩增质粒pMD19-T连接，转入大肠杆菌E.coliDH5α。转化成功后，利用蓝白斑实验筛选阳性重组子，经PCR鉴定后送至华大基因测序。测序结果显示：4种目的基因大小都是957 bp，两端都含有NdeI与XhoI酶切位点，但基因DNA序列的个别碱基略有不同。考虑到密码子存在兼并性，将4种酯酶基因的DNA序列翻译为氨基酸后，再与日本盐野义公司的枯草芽孢杆菌SHS 0133所表达的脱乙酰基酯酶进行氨基酸序列的比对，结果如表2所示。由表2可知：本研究获得的4种不同枯草芽孢杆菌来源的CAH基因所表达的蛋白都不相同，但是差异不大，且差异位点皆不是其活性位点。与盐野义公司的CAH序列相似度在98%～99%之间，其中XSA12与SIL3与之差异最小，只有3个氨基酸的差异。将上述4种CAH基因提交GenBank 获得相应的登录号：JX036322～JX036325。

表2 4种CAH与盐野义公司CAH的氨基酸序列差异

注：括号中为盐野义公司CAH的氨基酸。

2.2 4种CAH在大肠杆菌中的诱导表达

提取含有酯酶CAH基因的pMD19-T质粒，与诱导型表达质粒pET-24a、pET-28a一起用限制性内切酶NdeI与XhoI进行双酶切。将酶切后的CAH基因片段与pET-24a、pET-28a酶切片段进行回收纯化，连接后转入克隆型菌株大肠杆菌E.coliDH5α中。菌落PCR法分别筛选出8株阳性克隆并保种，提取质粒转入表达型菌株大肠杆菌E.coliBL21感受态中。利用菌落PCR的方法，对转化后涂布的8个LB固体培养基上生长的菌落进行阳性克隆的筛选。将8株PCR验证过的阳性克隆菌送去华大基因测序，测序结果显示：诱导型菌株全部构建成功，分别得到了CAH前端不含His标签的诱导型工程菌E.coliBL21/pET24a-1.107、E.coliBL21/pET24a-XSA12、E.coliBL21/pET24a-YIS、E.coliBL21/pET24a-SIL3；CAH前端带有His标签的诱导型工程菌E.coliBL21/pET28a-1.107、E.coliBL21/pET28a-XSA12、E.coliBL21/pET28a-YIS、E.coliBL21/pET28a-SIL3。

将上述8株工程菌接种于LB 液体培养基内，37 ℃培养至对数期，在IPTG的诱导下，20 ℃培养20 h，菌体OD为2.0～2.5。离心收集菌体后清洗2次，最后加入0.1 mmoL/L、pH 8.0的磷酸钠缓冲液进行破碎。破碎后全部进行聚丙烯酰胺-凝胶电泳(SDS-PAGE)，验证8株工程菌的目的蛋白的表达情况。蛋白电泳结果如图2所示。由图2可知：4种基因与pET-24a、pET-28a质粒组合的8株工程菌都在3.5×104左右出现明显的目的条带(与推测蛋白大小3.6×104基本相符)，说明经过诱导，它们都正常地表达了目的蛋白CAH。从基因差别上分析，XSA12与SIL3基因表达的活性蛋白量都要多于YIS与1.107基因，YIS基因表达量虽然较多，但多为无活性的包涵体，上清中的活性目的蛋白条带不明显；从质粒的角度上来看，pET-28a质粒对目的基因的表达情况都要略好于pET-24a质粒。

M为蛋白Marker；1为E.coli BL21/pET24a-1.107菌体破碎后的上清与沉淀；2为E.coli BL21/pET28a-1.107菌体破碎后的上清与沉淀；3为E.coli BL21/pET24a-XSA12菌体破碎后的上清与沉淀； 4为E.coli BL21/pET28a-XSA12菌体破碎后的上清与沉淀；5为E.coli BL21/pET24a-YIS菌体破碎后的上清与沉淀；6为E.coli BL21/pET28a-YIS菌体破碎后的上清与沉淀；7为E.coli BL21/pET24a-SIL3菌体破碎后的上清与沉淀；8为E.coli BL21/pET28a-SIL3菌体破碎后的上清与沉淀图2 8株诱导型菌株的CAH表达Fig.2 CAH expression of 8 inducible strains

将8株工程菌表达的CAH粗酶酶活测定结果列于表3中。由表3可以看出：不论是pET-24a质粒还是pET-28a质粒，XSA12与SIL3基因表达的CAH酶活都比另外2种基因要高，且SIL3的酶活最高，其中表达酶活最低的是YIS基因所表达的CAH。结合图2的电泳结果可以看出：虽然YIS基因的表达量不小，但多为无活性的包涵体；总体上看，诱导型质粒pET-28a对目的基因的表达情况也要优于pET-24a质粒，这与蛋白电泳图一致。综上所述，表达量与酶活最高的为工程菌E.coliBL21/pET28a-SIL3，其酶活为45.89 U/mL。

表3 4种CAH基因不同重组菌表达酶活的比较

注：*以7-ACA作为底物测定酶活。

2.3 4种CAH的纯化及动力学参数

因为诱导型工程菌E.coliBL21/pET28a-1.107、E.coliBL21/pET28a-XSA12、E.coliBL21/pET28a-YIS和E.coliBL21/ pET28a-SIL3表达的CAH前端带有His标签，所以可以利用Ni柱进行纯化。对洗脱浓度进行了一系列的优化后，确定了用洗脱液NPI 20洗涤与Ni柱结合的杂蛋白、用洗脱液NPI 150洗脱Ni柱结合的目的蛋白的纯化方法，最终得到了4种较纯的目的蛋白CAH。进行蛋白电泳，结果如图3所示。由图3发现，纯化后的蛋白较为纯净，杂带不明显，可以用于后续动力学参数研究。

M为标准蛋白; 1为CAH-1.107；2为CAH-XSA12；3为CAH-YIS；4为CAH-SIL3图3 4种重组CAH的纯化Fig.3 Purification of the four kinds of recombinant CAH

通过比较4种纯酶的Km值，可以比较其催化性能的优劣。因为CAH也可用于CPC转化为D-CPC的反应，所以分别测定了4种纯酶对7-ACA、CPC的Km值。经过多次重复与平行试验，最终得到对7-ACA、CPC的Km值与Vmax值，结果如表4所示。

表4 4种CAH对底物7-ACA、CPC的Km值与Vmax值

由表4可知:在4种基因中，SIL3基因所表达的CAH对7-ACA、CPC的Km值都是最低值，分别为9.88和17.6，说明它对7-ACA、CPC都有最佳的亲和力，可以高效地与底物结合，进而催化底物7-ACA、CPC转化成D-7-ACA、D-CPC。日本盐野义制药公司枯草芽孢杆菌SHS 0133 CAH对7-ACA、CPC的Km值分别为7.90 和24.0[13]。而SIL3基因所表达的CAH对7-ACA的Km值略高于盐野义公司CAH，对CPC的Km值低于盐野义公司CAH。因此，SIL3基因所表达的CAH也具有工业化开发的潜力。

2.4 4种CAH在大肠杆菌中的组成型表达

构建的8株诱导型菌株在LB液体培养基中生长缓慢，20 h后菌体密度最大也只能达到2.5左右，且诱导型菌株需要诱导剂的加入和低温条件下进行诱导，设备要求高、成本高，不利于大规模工业化生产。因此，有必要构建一种适用于CAH在大肠杆菌中高效表达的组成型表达系统。启动子序列、质粒拷贝数以及SD序列与起始密码子ATG的间隔序列的长度、碱基组成都能对蛋白的表达造成重要影响。为此，按照1.2.3节的方法，本研究构建了16种CAH组成型表达质粒(表5)，并考察了它们CAH基因的表达情况。

表5 16种质粒的组成情况

2.4.1 间隔序列碱基组成对CAH表达的影响

为了考察SD序列与起始密码子ATG之间的间隔序列碱基组成对CAH表达的影响，选用同样是不含终止子序列的B1-XSA12-K、B1-SIL3-K与B2-XSA12-K、B2-SIL3-K两组质粒，对其工程菌进行培养并考察发酵24 h后的CAH的表达情况，结果见图4。由图4可以看出：SD序列与ATG的间隔序列的碱基差异对于基因的表达有很大影响。与间隔序列为B2的工程菌相比，间隔序列为B1的工程菌的酶活都更高，蛋白电泳图中可以看出目的蛋白条带更粗、杂带更少。酶活测定结果表明(数据未显示)：当间隔序列为B1时，XSA12、SIL3的酶活达到110.22和114.71 U/mL，分别是对应间隔序列为B2的1.89倍与1.67倍。根据上述实验结果，确定SD序列与起始密码子ATG的间隔序列的碱基组成对基因表达的确起着重要的影响。在本研究中，当间隔序列为B1时更适合于CAH的表达。推测原因可能是以B1作为间隔序列时，能使SD序列与起始密码子ATG之间的茎环结构更加稳定，并能将SD序列与起始密码子拉到最适距离，并通过将起始密码子ATG放于茎环结构突出的环形“头部”，使与SD序列结合的核糖体小亚基更快地识别出起始密码子并进行转录起始。而以B2作为间隔序列时，可能形成的茎环结构没有间隔序列B1那么稳定，所以在转录效率上略低一些。

M为标准蛋白；1、2分别为E.coli DH5α/B1-XSA12-K破碎后的上清与沉淀；3、4分别为E.coli DH5α/B1-SIL3-K破碎后的上清与沉淀；5、6分别为E.coli DH5α/B2-XSA12-K破碎后的上清与沉淀；7、8分别为E.coli DH5α/B2-SIL3-K破碎后的上清与沉淀图4 间隔序列碱基组成对CAH表达的影响Fig.4 Effects of the spacing sequence composition on the CAH expression

2.4.2 终止子有无对CAH表达的影响

为了考察终止子的有无对基因表达的影响，选用同样含有SD序列与ATG的间隔序列为B1的B1-XSA12-K、B1-XSA12-R与B1-SIL3-K、B2-SIL3-R两组质粒，对其工程菌进行培养并测定发酵24 h后的OD、酶活与比酶活，结果见表6。由表6可以看出，终止子的有无对于基因的表达有很大影响。与对应的不含终止子序列的工程菌相比，含有终止子序列的工程菌的菌浓与酶活都偏低，约为前者的30%～40%，但比酶活水平基本一致。推测原因是由于终止子的存在，使得细胞对转录的监控更加严密，细菌生长缓慢而导致蛋白表达量低。

表6 终止子序列对重组菌株表达CAH的影响

2.4.3 不同CAH基因的组成表达

虽然2.3节中研究了不同CAH对底物CPC与7-ACA的催化能力，但是由于质粒的更换以及各基因调控元件的变化，可能对各基因本身的蛋白表达水平造成了不同的影响。为了选择最优的CAH基因与质粒的组合从而得到最佳工程菌，需要研究与新载体组合后各基因的蛋白表达能力。选用同样不含终止子序列、SD序列与ATG的间隔序列为B1的B1-1.107-K、B1-XSA12-K和B1-YIS-K、B1-SIL3-K 4种质粒，对其工程菌进行培养并测定发酵24 h后的OD、酶活与比酶活，结果见表7。由表7可以看出：相对于1.107、YIS基因，SIL3与XSA12基因的蛋白表达水平和蛋白产物对底物CPC与7-ACA的催化能力更高。其中，SIL3基因表达出来的CAH蛋白对底物CPC与7-ACA表现出最高的酶活与比活，而YIS虽然得到表达，但多为包涵体形式，酶活、比酶活较低，这些都与诱导型质粒的表达情况基本一致。

2.4.4 宿主对CAH表达的影响

不同宿主对组成型质粒的表达也具有很大的影响。选用同样不含终止子序列、SD序列与ATG的间隔序列为B1的B1-1.107-K、B1-XSA12-K、B1-YIS-K、B1-SIL3-K这4种质粒分别转入不同的宿主E.coliDH5α和E.coliJM109中，研究宿主不同对基因表达的影响，结果见表8。由表8可以看出：在相同的培养时间内，含有相同质粒的以E.coliJM109为宿主菌的工程菌比以E.coliDH5α为宿主菌的工程菌生长慢，表达的酶活低，所以选择E.coliDH5α作为宿主来进行CAH的表达。

表7 不同CAH基因的组成型表达情况

表8 不同宿主菌对CAH表达的影响

通过对上述几个因素的考察，最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL3基因、trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒pB1-SIL3-K为最佳表达质粒，以E.coliDH5α为最佳宿主菌。重组菌E.coliDH5α/pB1-SIL3-K在37 ℃培养24 h，酶活达到了138.61 U/mL。以E.coliDH5α/pB1-SIL3-K为工程菌株，对其培养基组成、培养条件、放大过程等进一步做了优化，在7 L发酵罐上，培养24 h后CAH最高酶活达到1 340 U/mL，此表达水平高于盐野义公司的报道值[12]，为目前国内外文献报道的最高水平。

3 结论

从不同枯草芽孢杆菌中克隆CAH基因，并尝试在大肠杆菌中进行诱导型和组成型表达，以期获得最佳的CAH大肠杆菌重组表达工程菌，为CAH高效、低成本发酵制备奠定基础。论文主要结论如下：

1)从4株枯草芽孢杆菌中克隆得到4个不同CAH基因序列1.107、XSA12、YIS、SIL3。

2)4个CAH基因通过两种诱导表达质粒(pET-24a与pET-28a)重组表达，酶活最高的诱导型工程菌为E.coliBL21/pET28a-SIL3，培养24 h，酶活达到45.89 U/mL。

3)SIL3基因所表达的CAH对7-ACA、CPC的Km值都是最低值，分别为9.88 mmoL/L和17.60 mmoL/L。

4)SD序列与起始密码子ATG的间隔序列的碱基组成、终止子、CAH基因差异、宿主菌差异对CAH的组成型表达均有影响。

5)E.coliDH5α/pB1-SIL3-K为最佳的组成型表达菌株，培养24 h，OD可以达到5.40，以7-ACA为底物测定酶活达到138.61 U/mL。经过优化及放大，培养24 h后CAH最高酶活达到1 340 U/mL。

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(责任编辑 荀志金)

Inducible and constitutive expression of cephalosporin-Cdeacetylase fromBacillussubtilisinEscherichiacoli

ZHU Ying1,MA Xiaoqiang1,YANG Shengli1,WEI Dongzhi1,SU Erzheng1,2

(1.New World Institute of Biotechnology,State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Enzyme and Fermentation Technology Laboratory,College of Light Industry Science and Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

In this work,8 inducible plasmids and 16 constitutive plasmids were constructed to fulfil the high-level heterogenous expression of cephalosporin-C deacetylase (CAH) gene inEscherichiacoli. A constitutive expression plasmid pB1-SIL3-K,with a replication origin derived from pUC19 and B1 sequence between theSIL3gene andtrppromoter,was selected as the most efficient expression plasmid.The OD and CAH activity expressed byE.coliDH5α/pB1-SIL3-K attained 5.4 and 138.61 U/mL when cultivating at 37 ℃ for 24 h.Furthermore, 1 340 U/mL of CAH activity was obtained in a 7-L fermenter by optimizing the medium components,culture conditions and scale-up process,which is the highest CAH activity reported to date.

cephalosporin-C deacetylase; inducible expression; constitutive expression; 3′-deacetyl-7-aminocephalosporanic acid

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.004

2016-06-27

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2012CB721003)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA022206B)；中央高校基本科研业务费专项资金；生物反应器工程国家重点实验室开放课题

朱 颖(1987—)，女，山东聊城人，研究方向：酶工程；魏东芝(联系人)，教授，dzhwei@ecust.edu.cn；苏二正(联系人)，副教授，E-mail:ezhsu@njfu.edu.cn

TQ925

A

1672-3678(2017)02-0021-09