日落黄与牛血清白蛋白相互作用的电化学研究

李金凰，陈毅挺,2，郑晶晶，潘 彦

(1.闽江学院 化学与化学工程系，福建 福州 350108；2.绿色染整福建省高校工程研究中心，福建 福州 350108)

日落黄与牛血清白蛋白相互作用的电化学研究

李金凰1，陈毅挺1,2，郑晶晶1，潘 彦1

(1.闽江学院 化学与化学工程系，福建 福州 350108；2.绿色染整福建省高校工程研究中心，福建 福州 350108)

利用微分脉冲伏安法，研究了日落黄与牛血清白蛋白之间的相互作用. 试验结果表明，日落黄与牛血清白蛋白之间形成近似1∶1的复合物，从而造成日落黄峰电流的降低，两者之间的结合主要依靠静电力，且结合常数随温度升高而降低. 研究有利于从分子水平上了解日落黄和牛血清白蛋白之间的结合作用，为更进一步了解日落黄的生物代谢机理提供一定的理论参考.

日落黄；牛血清白蛋白；电化学

日落黄(Sunset Yellow，SY)是一种人工合成的偶氮类色素(结构式如图1所示)，属我国允许使用的食品添加剂之一[1]，但其具有慢性毒性和致癌性[2]. 探索SY与蛋白质之间的结合行为，对于了解其在生物体内的作用机制具有一定的意义.

图1 日落黄的结构式Fig.1 Structural formula of SY

常用于探究分子与牛血清白蛋白(BSA)结合作用的方法有分光光度法[3-4]、荧光光谱法[5-6]、毛细管电泳法[7]、色谱法[8]、电化学分析法[9]和圆二色光谱法[10]等. 近年来，电化学分析法以其操作简便、灵敏度高等优点而被用于蛋白与某些小分子之间相互作用行为的研究. 莫述诚等[11]和石震等[12]分别利用电化学分析法研究了日落黄在银基汞膜电极和乙炔黑-壳聚糖修饰电极上的伏安行为，但他们均未对日落黄与BSA的结合行为进行探讨. 本文使用微分脉冲伏安法探究了不同温度和酸度下SY与BSA的结合常数和结合位点数，并对作用力的类型进行了判断.

1 试验部分

1.1 仪器与材料

CHI 760D(上海辰华仪器有限公司)；三电极体系：玻碳电极(Φ 3 mm，上海辰华仪器有限公司)为工作电极；饱和甘汞电极(232型，上海恒誉水分析仪器厂)为参比电极；铂丝电极(1 mm×37 mm，上海辰华仪器有限公司)为辅助电极.

日落黄(分析标准品)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白(相对分子质量65 000，生化试剂)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸购自上海成海化学工业有限公司；氧化铝购自天津艾达恒晟科技发展有限公司. 所有试剂未注明的均为分析纯，试验用水均为去离子水.

1.2 试验方法

玻碳电极在测定之前，先用氧化铝悬浊液在麂皮上抛光至镜面，用去离子水冲洗干净，用氮气吹干后置于待测溶液中进行电化学测量. 在最优参数下(脉冲周期：0.2 s、采样宽度：0.04 s、脉冲幅度：0.05 V、电位增量：0.005 V、电位范围0.1～-0.9 V)对含有SY和BSA的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液进行微分脉冲伏安法扫描. 根据加入BSA前后SY峰电流差值的变化，测得SY与BSA相互作用的结合常数与结合位点数.

2 结果与讨论

2.1 微分脉冲伏安法测定日落黄的参数优化

保持日落黄溶液浓度不变，逐一改变脉冲周期、采样宽度、起始电位、终止电位、电势增量和振幅，考察不同参数对日落黄峰电流的影响. 试验结果如图2所示.

图2 电化学参数对峰电流的影响Fig.2 Effect of electrochemical parameters on peak current

由图2可见，当脉冲周期、采样宽度、脉冲幅度、电位增量、起始电位和终止电位分别为0.2 s、0.04 s、0.05 V、0.005 V、0.1 V、-0.9 V时，日落黄的峰电流最大.

2.2 SY-BSA体系的微分脉冲伏安分析

在上述最优参数下，对SY及SY-BSA体系进行微分脉冲伏安扫描，其曲线如图3所示.

图3 SY、SY-BSA体系的微分脉冲扫描伏安图Fig.3 Differential pulse sweep voltammetric curves of SY and SY-BSA(a)1.0×10-4 mol/L SY；(b) a+1.2×10-7 mol/L BSA

在pH 7.2的Tris-HCl缓冲溶液中，SY在玻碳电极上产生了一个灵敏的氧化峰，加入BSA后SY的峰电流降低，峰电位略微发生移动，表明二者之间发生结合作用，生成了一种非电活性复合物[13]. BSA 的空间结构由3 个结构域组成，每个结构域有2 个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部，构成疏水性腔[14-15]，SY易进入蛋白的疏水空腔中，从而使其电活性基团隐藏于BSA 内部导致峰电流的下降，因此SY在BSA 分子上的结合位点可能主要位于BSA 疏水腔内[16].

根据图3，假定日落黄与BSA只形成一种简单的化合物BSA-nSY，则结合常数和结合数可根据式(1)求得[17].

log[ΔI/(ΔImax-ΔI)]=logβ+nlog[SY]

(1)

式中，ΔI表示引入BSA前后SY峰电流的差值；ΔImax表示的是峰电流的最大差值；n为结合位点数；β表示平衡常数，在BSA-nSY体系中即为结合常数. 根据加入BSA前后SY溶液(pH7.2,20 ℃)所测得的峰电流差值ΔI，即可得到图4的曲线.

图4 Ip与日落黄浓度的关系图Fig.4 Relation of Ip and concentration(a)SY；(b) SY+BSA(1.19×10-7 mol/L)；(c) △I

2.3 不同环境温度和酸度对日落黄与BSA相互作用的影响

为了研究体系环境对SY与BSA相互作用的影响，考察了不同温度和酸度下SY-BSA的结合常数和结合数，结果如表1、表2所列.

由表1可见，温度对SY与BSA 的结合行为有所影响.随着温度的升高，两者的结合常数呈逐渐降低的趋势，这与SY和BSA由于形成复合物而引起BSA荧光的静态猝灭现象相符[18].

表1 不同温度下SY与BSA的结合常数和结合数(pH 7.2)Table 1 Binding constants and binding numbers of SY-BSA at different temperatures(pH 7.2)

表2 不同pH下SY与BSA的结合数和结合常数(T=293 K)Table 2 Binding constants and binding numbers of SY-BSA at different pHs(T=293 K)

由于牛血清白蛋白的pI在4.6～5.8之间，当pH高于5.0后，SY与BSA结合常数和结合位点基本不变，但是与pH 3.5时的数据相比则有所增强，估计是由于此时SY带正电，而BSA带负电，二者之间的静电作用使得结合常数Ka略有上升[19].

2.4 日落黄与BSA相互作用的作用力类型判断

当温度变化不大时，热力学参数可通过下列公式求得[20]：

lnKa=-(ΔH/RT)+ΔS/R

(2)

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

式中，Ka表示SY与BSA的结合常数，T表示温度.

根据式(2)可求得反应的自由能变ΔG和熵变ΔS，而当温度变化不大时，反应的焓变ΔH视为常数，可根据式(3)求得. 对于本试验体系，将试验得到的不同温度下结合常数Ka值代入上述热力学公式，即可求得日落黄与BSA反应的有关热力学参数，如表3所列.

表3 日落黄与BSA结合的热力学参数Table 3 Thermodynamic constants for system of SY-BSA

小分子与蛋白质之间的作用力主要包括疏水作用力、静电相互作用、氢键以及范德华力. 可以根据反应热力学参数的大小和正负来判断染料分子与蛋白质结合的主要作用力类型. 由表3可见△G <0，说明结合反应可以自发进行；而ΔH<0、ΔS>0，则表示SY与BSA之间的作用力主要为静电力，这与不同酸度下结合常数的变化趋势相符.

3 结论

利用微分脉冲伏安法研究了日落黄与牛血清蛋白的相互作用，试验结果表明，两者之间主要依靠静电作用力形成近似1∶1的复合物，从而造成日落黄峰电流的降低. 该研究可以为更深入的了解染料与蛋白质的作用机制提供理论参考.

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Electrochemical Studies on Interaction between Sunset Yellow and Bovine Serum Albumin

LI Jin-huang1, CHEN Yi-ting1,2, ZHENG Jing-jing1, PAN Yan1

(1.ChemistryandChemicalEngineeringDepartmentofMinjiangUniversity,Fuzhou350108，China; 2.EnngineeringResearchCenterofGreenDyeingandFinishinginFujianProvincialUniversity,Fuzhou350108，China)

The interaction between sunset yellow (SY) and bovine serum albumin (BSA) was studied by differential pulse voltammetry. The results showed that the decrease of peak current was caused by the formation of SY and BSA (approximately, 1∶1)composite. The electrostatic force played the main role in their combination. The binding constant was decreased with increasing temperature. The research results are helpful in understanding the metabolism mechanism of SY and BSA at a molecular level, and provide some theoretical references for the study of the biological metabolism mechanism of SY.

sunset yellow; bovine serum albumin; electrochemical

研究报告(006～010)

2016-12-13;

2017-02-22.

国家自然科学基金(21405075)；福建省工业科技计划重点项目(2014H0040)；福建省高校青年自然基金重点项目(JZ160468)；国家级大学生创新创业项目(201610395009)；闽江学院科技项目(MYK15001)资助

李金凰(1995-)，女，本科生，E-mail: 731415770@qq.com

陈毅挺(1978-)，教授，博士，研究方向为化学传感器与现代分离分析研究工作，E-mail: fjcyt@foxmail.com.

O657.1

A

1006-3757(2017)01-0006-05

10.16495/j.1006-3757.2017.01.002