抗肿瘤药H6聚合物胶束的制备及体外抗肿瘤作用研究

潘超，刘会丽，许俊鹏，唐俏欣，万丽#（.成都中医药大学药学院，成都 637；.四川大学生物治疗国家重点实验室，成都 6004）

抗肿瘤药H6聚合物胶束的制备及体外抗肿瘤作用研究

潘超1，2＊，刘会丽2，许俊鹏1，唐俏欣1，万丽1#（1.成都中医药大学药学院，成都 611137；2.四川大学生物治疗国家重点实验室，成都 610041）

目的：制备抗肿瘤药H6（内酯类化合物）聚合物胶束，考察其体外抗肿瘤作用。方法：以甲氧基聚乙二醇-聚（ε-己内酯）（mPEG2000-PCL4000）为载药材料，制备H6/mPEG2000-PCL4000胶束。以粒径、多分散系数（PDI）和48 h是否产生沉淀为指标筛选处方投料比、H6质量浓度、有机溶剂体积比，检测所制胶束的包封率和载药量。采用MTT法检测所制胶束与H6溶液对人非小细胞肺癌细胞A549、人肺癌细胞H460的毒性。结果：确定处方为投料比为1∶25、H6质量浓度为2 mg/mL、乙醇-氯仿为1∶1（V/V）；所制备的H6/mPEG2000-PCL4000胶束的粒径为（40.74±0.116 3）nm，PDI为0.101±0.006，包封率为（94.87±0.016 3）%，载药量为（7.07± 0.001 5）%（n＝3）。胶束和H6溶液对A549细胞的IC50分别为15.62、12.57 nmol/L，对H460细胞的IC50分别为27.68、15.19 nmol/L。结论：成功制得H6/mPEG2000-PCL4000胶束，其具有体外抗肿瘤作用。

抗肿瘤药H6；mPEG2000-PCL4000；胶束；抗肿瘤作用

H6为四川大学生物治疗国家重点实验室合成的小分子抗肿瘤药物，分子内含有酰胺及内酯，与其结构相似的化合物有CA4、MPC-6827、香豆素等。前期研究表明H6对多种肿瘤细胞具有抑制作用，且H6具有良好的肺靶向性和低心脏毒性，尤其能剂量依赖性地抑制卵巢肿瘤和乳腺肿瘤的生长，是一个很有前景的抗有丝分裂治疗癌症的化合物[1]。但是由于H6在水中几乎不溶并且在给药过程中不稳定，极大地限制了其临床应用。

聚合物胶束为一种新型的药物给药传递系统，能够改善原型药物的溶解性、降低药物毒性，而且胶束的疏水性内核为难溶性药物提供了一个天然载药环境，使药物更加稳定[2]。胶束作为药物载体，具有提高药物溶解度和安全性、降低毒副作用、增强药物疗效等优点[3-5]。甲氧基聚乙二醇-聚（ε-己内酯）[Monomethoxyl poly（ethyleneglycol）-b-poly（ε-caprolactone），mPEG-PCL]由于具有两亲性且易于合成而成为理想的候选载体，在制备聚合物胶束中被广泛应用。本文以mPEG2000-PCL4000为载药材料、H6为原型药物制备了一种新型的载药胶束传递系统（H6/mPEG2000-PCL4000胶束），并对其进行物理表征和体外抗肿瘤作用研究。H6的化学结构式见图1。

图1 H6的化学结构式Fig 1 Chemical structural formula of H6

1 材料

1.1 仪器

AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Thermo Heraeus Fresco 17低温冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）；Waters Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Malvern ZEN3600激光粒度仪（美国Malvern公司）。

1.2 药品与试剂

H6原料药（四川大学生物治疗国家重点实验室自制，批号：20160609，纯度：＞98%）；mPEG2000-PCL4000（济南岱罡生物工程有限公司，批号：Fl121002）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；MTT细胞增殖及细胞毒性测试盒（北京索莱宝科技公司）；DMEM细胞培养基、1640细胞培养基、Tyrpsin胰酶、胎牛血清（美国HyClone公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 细胞

人非小细胞肺癌细胞株A549、人肺癌细胞株H460均购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），由四川大学华西生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种。

2 方法

2.1 H6/mPEG2000-PCL4000胶束的制备

按投料比称取H6原料药和相应质量的mPEG2000-PCL4000于茄形瓶中，加入氯仿-乙醇，室温下超声完全溶解，在50℃水浴加热条件下减压旋转蒸发30 min除去有机溶剂成膜，将上述聚合物薄膜置于真空干燥箱中干燥过夜以除去残留的有机溶剂，加入预热至55℃的超纯水中，55℃水浴中振摇水化成胶束。胶束溶液趁热过0.22 μm注射式微孔滤膜以除去未包封的药物，加入15%蔗糖与6%甘露醇作为冻干保护剂，4℃下避光密封保存。

2.2 处方筛选

以粒径、多分散系数（PDI）和48 h是否产生沉淀（肉眼观察）为指标，采用单因素试验对H6/mPEG2000-PCL4000胶束的处方进行筛选。

2.2.1 投料比 按“2.1”项下方法制备胶束，H6用量为5 mg，超纯水体积为5 mL，氯仿-乙醇为1∶1（V/V），考察投料比（H6∶mPEG2000-PCL4000，m/m）分别为1∶20、1∶25、1∶30时对胶束的影响。

2.2.2 H6质量浓度 按“2.1”项下方法制备胶束，H6用量为20 mg，投料比为1∶25，氯仿-乙醇为1∶1（V/V），考察超纯水体积分别为5、10、20 mL时（H6质量浓度分别为1、2、4 mg/mL）对胶束的影响。

2.2.3 有机溶剂体积比 按“2.1”项下方法制备胶束，H6用量为5 mg，投料比为1∶25，超纯水体积为5 mL，考察氯仿-乙醇（V/V）分别为1∶1、1∶2时对胶束的影响。

2.3 质量控制指标测定方法

2.3.1 含量测定 精密量取H6/mPEG2000-PCL4000胶束溶液100 μL，加入900 μL甲醇，超声，13 000 r/min（离心半径8.6 cm）离心3 min，取上清液，采用高效液相色谱法按预试验得出的色谱条件进样测定，计算H6含量。色谱柱：Sunfire（150 mm×4.6 mm，5µm）;流动相：甲醇-水（70∶30），流速：1 mL/min；柱温：25℃；进样量：10 μL；检测波长：310 nm。按方法学考察本方法的回归方程、线性范围、回收率、精密度。

2.3.2 包封率（EE）与载药量（DL）测定 参考文献[6-7]方法，采用过滤法分离所制H6/mPEG2000-PCL4000胶束和游离的H6。取过滤后的H6/mPEG2000-PCL4000胶束溶液50 μL，加入950 μL乙腈稀释，超声1 min使包封的H6释放出来，13 000 r/min（离心半径8.6 cm）离心3 min，取上清液测定H6含量，平行测定3次。按公式EE（%）＝胶束中包载的H6含量/H6的投料量×100%，DL（%）＝胶束中包载的H6含量（/H6的投药量+mPEG2000-PCL4000的投药量）×100%计算EE和DL。

2.3.3 粒径测定 将所制H6/mPEG2000-PCL4000胶束稀释10倍，设置测定温度为25℃，采用Malvern激光粒度仪测定粒径和PDI，测定3次取平均值。

2.4 体外抗肿瘤试验

2.4.1 细胞培养 取A549和H460细胞分别置于含10%胎牛血清、10 u/mL青霉素、10 μg/mL链霉素和10%非必需氨基酸的1640培养基中，于饱和湿度、3℃的5%CO2恒温培养箱培养。

2.4.2 溶液的制备 以DMSO为溶剂，分别配制质量浓度为1 mg/mL的H6/mPEG2000-PCL4000胶束溶液和质量浓度为10 mg/mL的H6溶液（均以H6计）。

2.4.3 体外抗肿瘤试验 采用MTT法[8-9]评价H6/ mPEG2000-PCL4000胶束对A549、H460细胞的毒性，以H6溶液为对照。分别收集对数生长期的A549、H460细胞，用培养基稀释成约3×103个/mL的细胞悬液，每孔100 μL接种到96孔板中，待细胞生长24 h后，每孔加入100 μL含不同浓度（1、10、50、200、500 nmol/L）H6的培养基溶液，每个浓度3个复孔；同时设不加药物的阴性对照。放入恒温培养箱中培养48 h，取出，在避光条件下每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养3 h。取出，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上室温振摇10 min，待蓝色结晶充分溶解后，用酶标仪在570 nm波长处测定光密度（OD）[10]。计算细胞抑制率（%）＝（1－加药孔的测定值/阴性对照孔的测定值）×100%，以及半数抑制浓度（IC50）。

2.5 统计学方法

3 结果

制得H6/mPEG2000-PCL4000胶束为带黄色乳光的澄清透明溶液。

3.1 处方筛选结果

3.1.1 投料比 投料比为1∶20、1∶25、1∶30时，胶束粒径分别为40.08、42.58、44.61 nm，PDI分别为0.199、0.121、0.318；除投料比为1∶20时胶束放置24 h未见沉淀、48 h后有颗粒状沉淀外，其余胶束放置48 h均未见沉淀。这提示随着投料比增加，胶束更加稳定，但粒径也略有增大。综合考虑稳定性好的同时粒径要小，选择投料比为1∶25。

3.1.2 H6质量浓度筛选结果 当H6质量浓度为1、2、4 mg/mL时，胶束粒径分别为42.09、40.74、45.13 nm，PDI分别为0.130、0.101、0.113，放置48 h均未见沉淀。这提示H6质量浓度间的粒径和PDI差异并不明显，综合考虑选择胶束浓度为2 mg/mL。

3.1.3 有机溶剂体积比筛选结果 当氯仿-乙醇分别为1∶1、1∶2时，胶束粒径分别为40.74、40.25 nm，PDI分别为0.101、0.236，放置48 h均未见沉淀。这提示随着乙醇的增加，胶束粒径和稳定性无明显变化，但考虑到乙醇含量较高时，在旋蒸过程中消耗的时间会延长，H6易氧化且见光分解，最终选择乙醇-氯仿为1∶1（V/V）。

3.2 质量控制指标测定结果

3.2.1 方法学考察结果 以峰面积（y）与H6质量浓度（x）进行回归得回归方程为y＝23 306x+66 404（r2＝0.999 7），H6检测质量浓度的线性范围为0.2～1 000 μg/mL，平均回收率为99.7%（RSD＝0.41%，n＝9），日内RSD＝0.12%（n＝6），日间RSD＝0.27%（n＝6）。

3.2.2 粒径、包封率及载药量测定结果 所制H6/ mPEG2000-PCL4000胶束的平均粒径为（40.74±0.116 3）nm，PDI为0.101±0.157，包封率为（94.87±0.016 3）%，载药量为（7.07±0.001 5）%（n＝3）。

3.3 体外抗肿瘤活性测定结果

结果显示，H6/mPEG2000-PCL4000胶束和H6溶液对A549、H460细胞均表现出细胞抑制作用，且呈剂量依赖性，随着H6浓度增加，细胞抑制率增加，其中对A549细胞的抑制作用较强。H6/mPEG2000-PCL4000胶束和H6溶液对A549的IC50分别为15.62、12.57 nmol/L，对H460细胞的IC50分别为27.68、15.19 nmol/L。H6/mPEG2000-PCL4000胶束和H6溶液对A549、H460细胞抑制率的影响见图2。

图2 H6/mPEG2000-PCL4000胶束和H6溶液对A549、H460细胞抑制率的影响（n＝3）Fig 2 Inhibition ratio of H6/mPEG2000-PCL4000micelles and H6 solution toA549 cell and H460 cell（n＝3）

4 讨论

本实验成功制备了H6/mPEG2000-PCL4000胶束，并对其理化性质进行了一系列的表征；体外抗肿瘤活性表明，H6/mPEG2000-PCL4000胶束与H6溶液具有相同活性。

本研究发现，H6/mPEG2000-PCL4000胶束的包封率和载药量不是很高，提示mPEG2000-PCL4000材料对H6的包合效果不是很理想，笔者后期会尝试其他类型的聚合物载体；另外，本文中有机溶剂用到了氯仿，虽然已通过长时间真空干燥来除去，但是氯仿毒性较强，后期会尝试采用二氯甲烷来代替氯仿。

H6/mPEG2000-PCL4000胶束和H6溶液对A549、H460细胞均有抑制作用。H460细胞中，H6/mPEG2000-PCL4000胶束的IC50相比H6溶液略大，可能是由于胶束溶液具有一定的缓释效应，降低了药物在细胞周围的浓度，从而降低了药物对细胞的抑制作用。对于A549细胞，H6/ mPEG2000-PCL4000胶束的IC50与H6溶液相差不大。综上所述，H6/mPEG2000-PCL4000胶束很好地保持了H6的抗肿瘤活性。

下一步，笔者还需对H6/mPEG2000-PCL4000胶束的体内药动学进行研究，考察其在体内的吸收代谢情况；而且要对其组织分布进行研究，验证H6/mPEG2000-PCL4000胶束载药系统在体内的靶向分布情况。

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（编辑：邹丽娟）

Study on Preparation of Anti-tumor Drug H6 Polymeric Micelles and Their in vitro Anti-tumor Effects

PAN Chao1，2，LIU Huili2，XU Junpeng1，TANG Qiaoxin1，WAN Li1（1.School of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.State Key Lab of Biotherapy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To prepare anti-tumor drug H6（lactone compound）polymeric micelles，and to investigate itsin vitroanti-tumor effects.METHODS：Using mPEG2000-PCL4000as carrier，H6/mPEG2000-PCL4000micelles were prepared.Using particle size，PDI and 48 h whether to produce precipitation as indexes，feeding ratio，H6 concentration，volume ratio of organic solvent were screened.The encapsulation efficiency and drug-loading amount of micelle were all detected.MTT assay was used to detect the tox-icity of micelles and H6 solution to human non-small cell lung cancer cell A549 and human lung cancer cell H460.RESULTS：The screened formulation was as follows as feeding ratio of 1∶25，H6 concentration of 2 mg/mL，the ratio of ethanol to chloroform of 1∶1（V/V）.The parameters of prepared H6/mPEG2000-PCL4000micelles were as follows as particle size of（40.74±0.116 3）nm，PDI of（0.101±0.006），encapsulation efficiency of（94.87±0.016 3）%，drug-loading amount of（7.07±0.001 5）%（n＝3）.IC50of micelles and H6 solution to A549 cell were 15.62 and 12.57 nmol/L；IC50of micelles and H6 solution to H460 cell were 27.68 and 15.19 nmol/L.CONCLUSIONS：H6/mPEG2000-PCL4000micelles are prepared successfully and show in vitro anti-tumor effects.

Anti-tumor drug H6；mPEG2000-PCL4000；Micelles；Anti-tumor effect

R943

A

1001-0408（2017）04-0533-04

2016-08-22

2016-11-11）

＊硕士研究生。研究方向：中药有效成分分析。电话：028-61800231。E-mail：1335126865@qq.com

#通信作者：教授，博士生导师。研究方向：药物分析、中药有效成分及质量标准研究。电话：028-61800231。E-mail：wanli8801@163. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.28