红花注射液通过抗炎症反应治疗急性脑梗死的机制研究*

秦秀德刘 玉李传朋李新悦王 钰虢周科△张国伟△

（1.广州中医药大学附属深圳市中医院，广东 深圳 518000；2.河北大学，河北 保定 071000）

·研究报告·

红花注射液通过抗炎症反应治疗急性脑梗死的机制研究*

秦秀德1刘 玉1李传朋1李新悦2王 钰2虢周科1△张国伟2△

（1.广州中医药大学附属深圳市中医院，广东 深圳 518000；2.河北大学，河北 保定 071000）

目的观察红花注射液对于脑卒中大鼠模型血清中超敏C反应蛋白（hs-CRP）炎性生物标志物表达的影响。方法用改良线栓法制作大鼠中动脉阻断（MCAO）模型，评定红花注射液对MCAO大鼠神经功能缺损、脑梗死面积等的影响，并采用ELISA法来检测hs-CRP在脑卒中大鼠模型中表达的水平。结果红花注射液能改善MCAO大鼠的的神经功能损伤情况；红花注射液12 h组的脑梗死面积与模型12 h组相比具有统计学意义（P＜0.05），红花注射液24 h组的脑梗死面积与模型24 h组相比具有统计学意义（P＜0.05）。红花注射液12 h组的hs-CRP与模型12 h组相比具有均有统计学差异（P＜0.01）。结论红花注射液能减小急性脑梗死MCAO大鼠的脑梗死面积，减轻炎症反应，对于脑卒中大鼠模型血清中超敏C反应蛋白这种炎性生物标志物表达有抑制作用。

急性脑梗死 超敏C反应蛋白 红花注射液

脑梗死是临床常见的重大疾病，如何更有效的防治脑梗死是国家战略层面重点研究的内容之一。脑血管病急性期炎症反应的严重程度与患者的预后关系密切。急性脑缺血后炎症反应存在有利的一面，也有有害的一面［1］。随着免疫学、分子生物学等医药卫生领域的发展，更多学者把眼光投向如何运用炎性生物标志物对脑卒中及其相关性疾病进行检测等方面的研究。本研究拟通过动物实验，探讨临床常用中成药红花注射液对脑梗死炎性标志物C反应蛋白（CRP）的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只健康雄性SD大鼠，体质量（250±20）g，SPF级，由军事医学科学院实验动物中心提供。许可证编号：SCXK-（军）2012-0004，饲料批号：SCXK（京）2015-0007。

1.2 试药与仪器 红花注射液（雅安三九药业有限公司）；依达拉奉注射液（国药集团国瑞药业有限公司）。大鼠超敏C反应蛋白（hs-CRP）试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）（北京索莱宝科技有限公司）；PBS磷酸盐 （北京博奥拓科技有限公司）；水合氯醛 （天津市科密欧化学试剂公司）；多聚甲醛（天津市科密欧化学试剂公司）。电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；双光束紫外可见分光光度计 （TU-1901）（北京普析通用仪器有限责任公司）；恒温水浴锅（DR-HW-2）（北京医疗设备总厂）；台式高速离心机（TG16W）（长沙易达仪器有限公司）；全自动酶标仪（ELx800）（美国BIO-TEK宝特）。

1.3 造模与分组 在24~26℃室温的实验室中饲养3 d，大鼠于晨8时给予食物20 g，自由饮水。手术大鼠术前禁食12 h，自由饮水，称体质量，采用改良线栓法制备脑缺血大鼠模型。先用质量分数为1%的戊巴比妥钠0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，将大鼠四肢和牙齿用棉线绳固定好，消毒，正中切口，钝性分离颈部肌肉，分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA），结扎ECA远心端、CCA近心端。动脉夹夹闭ICA，由CCA插入MCAO栓线，向颈内动脉（ICA）推进，至大脑中动脉（MCA），导致局灶性脑缺血［2］。10-0丝线缝合颈部切口。假手术组动物不插入MCAO栓线，术中严格控制室温在20~25℃。术前大鼠体质量控制在250~ 280 g范围内，可增加成功率。动物分组，SD雄性大鼠48只，随机分成8组，每组6只。分组如下：模型组12 h组（C-12组），模型组24 h组（C-24组），假手术12 h组（SC-12组），假手术24 h组（SC-24组），红花注射液12 h组（HH-12组），红花注射液24 h组（HH-24组），依达拉奉12 h组（YD-12组），依达拉奉24 h组（YD-24组）。分组后大鼠适应性饲养3 d后开始正式实验。给药剂量：1）依达拉奉注射液人体用药剂量为0.9 mg/kg，换算后大鼠的用药剂量为5.67 mg/kg，将依达拉奉加入0.9%氯化钠溶液2 mL溶解。12 h组和24 h组均为造模成功3 h后，进行尾缘静脉注射1次。2）红花注射液：红花注射液人体用药剂量为0.29 mL/kg，换算后大鼠的用药剂量为1.83 mL/kg。12 h组和24 h组均为造模成功后6 h后红花注射液尾缘静脉注射1次。

1.4 标本采集与检测 手术24 h后称取大鼠体质量，将大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血5 mL，3000 r/min离心10 min取上清液，并用ELISA试剂盒检测CRP。大鼠断头取脑，称取大脑湿质量后，放入-20℃冰箱中冰冻30 min后取出，沿大脑冠状方向均匀切成6片，在1%TTC中水浴并避光15 min染色。而后将脑切片分别放入多聚甲醛及组织保存液中以待病理检测。主要指标：模型制作前后大鼠体质量变化；大脑指数；血清中超敏C反应蛋白（hs-CRP）及白细胞介素1β（IL-1β）的水平；神经功能损伤评分：1）大脑指数。脏器指数=脏器湿质量（mg）/大鼠质量（g）×100%；2）大鼠神经功能损伤评分。神经功能损伤程度评分标准采用改良的Zea Longa标准分为6个等级。具体评分标准：0分，无缺陷；1分，不能伸展对侧前肢；2分，对侧前肢弯曲；3分，轻度向对侧转圈；4分，严重向对侧转圈；5分，对侧瘫痪。3）hs-CRP检测按照ELISA试剂盒步骤操作。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。计量资料以（s）表示，统计学分析采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较 见表1。假手术12 h与模型组12 h相比具有显著统计学差异（P＜0.05），假手术24h与模型24h相比具有显著统计学差异（P＜0.05）。其他组均无显著性差异。

2.2 各组大鼠脑梗死面积比 见表1。脑梗死面积比分析：假手术12 h组与模型12 h组相比具有统计学意义（P＜0.05），假手术24 h与模型24 h组相比具有统计学意义（P＜0.05），红花注射液12 h组与模型12h组相比具有统计学意义（P＜0.05），红花注射液24 h组与模型24 h组相比具有统计学意义（P＜0.05）。红花注射液12 h组与依达拉奉12 h组相比无统计学意义（P＞0.05），红花注射液24 h组与依达拉奉24 h组相比无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠hs-CRP水平比较 见表1。假手术12 h组与模型12 h组有显著性差异（P＜0.05），模型12 h组大鼠血清中CRP含量明显高于假手术12 h组；假手术24 h组与模型24 h组无显著性差异（P＞0.05），但是模型24 h组血清中CRP含量均值大于假手术24 h组，模型组血清中CRP炎性因子表达程度高；红花注射液12 h组CRP含量明显低于模型12 h组CRP含量（P＞0.05）；红花注射液24 h组与模型24 h组CRP含量虽然没有显著性差异，但红花注射液24 h组CRP含量均值比模型组24 h低，证实了红花注射液对24 h的大鼠模型血清中CRP起到一定抑制作用；红花注射液12 h组、依达拉奉注射液12 h组和红花注射液24 h组、依达拉奉注射液24 h组均无显著性差异。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积比及CRP水平比较（s）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积比及CRP水平比较（s）

组别 n CRP（ng/mL）CS-12组 6 20.66±2.08 CS-24组 6 20.30±0.76神经功能缺损评分 脑梗死面积比均值0 0 0 0 C-12组 6 27.23±5.65 3.99±0.82 0.40±0.033 C-24组 6 3.00±0.63 0.37±0.024 22.93±2.97 HH-12组 6 18.85±3.34 2.67±0.81 0.31±0.037 HH-24组 6 2.67±0.51 0.30±0.044 20.71±1.68 YD-12组 6 2.67±0.81 0.29±0.065 19.74±3.35 YD-24组 6 2.67±0.51 0.30±0.056 17.76±1.51

2.4 各组大鼠脑切片病理及炎症情况比较 见图1。病理切片显示，模型组局灶神经上皮胞浆透亮，似核周空晕，散在分布淋巴细胞；假手术组：散在分布淋巴细胞；红花注射液组局灶神经上皮胞浆透亮，散在较多分布的淋巴细胞；依达拉奉组散在分布少许淋巴细胞，近脑室为著，灶状淋巴组织聚集。

图1 各组大鼠脑病理切片比较（HE染色，400倍，100倍）

3 讨 论

现今由于吸烟、喝酒、夜生活过度、高脂肪饮食等不良生活习惯及高工作强度使脑卒中等心脑血管疾病的患病率显著升高。世界银行发布的报告中指出，慢性病已对中国国民健康造成不可估计的损失，慢性病死亡占死亡人数的比例已超过百分之八十多，其中，脑卒中对个体健康和生活造成的危害最大［3］。根据相关报告公布的数据，我国脑卒中患病率逐步升高。由此可见，我国脑卒中防控形势严峻［4］。

hs-CRP是急性时相蛋白，可以诱发炎症的级联反应，并对细胞因子的平衡起重要调节功能［5］。hs-CRP异常表达均对急性脑梗死病变的形成和进展起重要作用［6］。正常人血清中超敏CRP含量很少，几乎检测不到，但当机体出现炎症、创伤和心脑血管疾病时hs-CRP会升高。hs-CRP的水平与炎症的出现及其严重程度具有相关性。临床研究表明，患者hs-CRP、FIB水平均与NIHSS评分呈正相关（r分别为0.291、0.891，P＜0.05），并由此得出结论：hs-CRP、FIB水平的升高与脑梗死的发病关系密切，及时检测这两项指标的水平变化有助于脑梗死的早发现、早治疗［7］。hs-CRP浓度可以作为脑梗死高危人群的临床筛查工具指标［8］。

红花注射液是临床常用的中成药，因此本课题基于抗炎症反应来探讨红花注射液治疗脑梗死的部分作用机制。红花味辛微苦、性温，乃活血通经、祛瘀止痛之良药，素有“活血之王”的美称，其在脑血管的防治中发挥着重要作用。从红花中提取得到的红花黄色素可显著改善脑缺血性缺氧，并且红花黄色素的抗凝血作用可以抑制大鼠血栓形成［9］，对脑梗死具有较好的治疗效果［10］。研究表明，黄芪注射液加红花注射液促进脑缺血再灌注模型鼠NT-3的上调可能是其抗脑缺血再灌注损伤的作用机制之一［11］。红花黄色素可以明显改善急性脑梗死患者的血浆黏度，降低红细胞压积，纠正血液高黏状态［12］。红花注射液在大鼠脑缺血/再灌注损伤中通过增强机体SOD活性，降低MDA含量，达到其保护作用［13］。红花注射液显著减轻CH诱导的兔海马缺血缺氧性损伤，可能是通过抑制nNOS蛋白表达起作用的［14］。赵氏等［15］运用网络药理学理念和网络分析技术研究红花注射液主要活性成分对脑血管疾病网络的调控作用，结果成分-靶点网络含有940个节点，2360条连接。涉及的生物学过程主要有生物大分子合成及代谢、神经再生、凋亡、血管生成、免疫炎症反应、缺氧应激响应等，其中羟基红花黄色素A和槲皮素可能通过协同抗凋亡的作用发挥抗脑血管疾病作用。红花注射液广泛的用于脑梗死、冠心病等疾病的临床治疗，临床观察发现患者症状显著改善，且使用过程中无明显不良反应。崔氏等［16］通过对9项研究共800例患者的系统评价，肯定了红花黄色素对急性脑梗死治疗的有效性与安全性。

因红花注射液通过调节炎症反应标志物hs-CRP的研究较少，探究红花注射液对于脑卒中大鼠模型血清中hs-CRP这种重要的炎性生物标志物表达的影响有重要的意义。本实验研究表明，红花注射液能够改善急性脑梗死实验大鼠神经功能缺损，减轻炎症反应，抑制脑卒中大鼠血清中hs-CRP炎性生物标志物的表达，进一步明确了红花注射液对缺血性脑卒中有治疗作用的机理，也为红花注射液治疗某些炎症损伤疾病提供了一定的参考价值。下一步本课题将从氧化应激信号通路深化对红花注射液抗炎的机制研究。

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Study of Safflower Injection on Acute Ischemic Cerebral Infarction through Anti-inflammatory Way

QIN Xiude，LIU Yu，LI Chuanpeng，et al. Shenzhen TCM Hospital Affiliated to Guangzhou University of TCM，Guangdong，Shenzhen 518000，China.

Objective：To explore the effect of safflower injection on the expression of inflammatory bio-markers of hypersensitive C-reactive protein in MCAO model rats.Methods：MCAO model was established with reforming Longa method.The effect of safflower injection on the neurological deficits and infarct size in MCAO rats was evaluated.The expression level of inflammatory bio-markers of hypersensitive C-reactive protein was detected using ELISA method.Results：Neurologic impairment in rats：safflower injection could improve the neurologic function of MCAO rats.The brain infarction area ratio：there was significant difference between the 12 hours group of safflower injection and the model group（P＜0.05），and there was also significant difference between the 24 hours group of safflower injection and the model group（P＜0.05）.Serum hs-CRP concentration：there was significant difference between the hsCRP concentration of the safflower injection 12 hours group and the 12 hours model group（P＜0.05）.Conclusion：Safflower injection can reduce the infarct area of the stroke model rats，relieve inflammatory reaction and inhibit the expression of inflammatory biomarkers such as serum super-sensitive C-reactive protein.

Stroke；high-sensitivity C-reactive protein；Safflower injection

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0409-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.010

2016-12-06）

深圳市科技计划项目（JCYJ20150401163247219）

△通信作者（电子邮箱：xxzgw@126.com）