柴旭斌 周英杰
(河南省洛阳正骨医院,河南 洛阳 471002)
·研究报告·
羌归膝舒丸对兔膝关节骨关节炎模型关节液IL-1、TNF-α水平的影响*
柴旭斌 周英杰△
(河南省洛阳正骨医院,河南 洛阳 471002)
目的观察羌归膝舒丸干预后膝OA模型兔膝关节液中IL-1、TNF-α含量的变化,探讨羌归膝舒丸治疗膝骨性关节炎的作用机制。方法将42只新西兰大白兔随机抽出11只纳入空白组,余纳入模型组,模型组用管状石膏伸直位固定右后膝5周制作膝骨性关节炎模型,完成造模后,随机抽取空白组和模型组各1只兔子处死以验证模型成功后,拆除造模组石膏。将没有造模的剩余10只兔分为空白组(A组),造模成功的剩余30只兔随机分为模型组(B组)、羌归膝舒丸组(C组)、盐酸氨基葡萄糖组(D组)。C组予以与60 kg体质量人等效剂量的羌归膝舒丸悬浊液10 mL、D组予以与60 kg体质量人等效剂量的盐酸氨基葡萄糖混悬液10 mL灌胃,A、B组予以10 mL蒸馏水灌胃,灌胃处理3周后处死,行各组肉眼观察膝关节大体形态以及取股骨髁软骨行光镜观察,ELISA法测定膝关节液中IL-1以及TNF-α含量。结果1)造模5周后,造模组膝关节出现明显的退行性改变。2)治疗后肉眼观察B、C、D组较A组相比均有退变,C、D组的退变程度较B组轻。光镜下B、C、D组均可见软骨退变的病理变化。3)治疗后B、C、D组与A组相比较关节液中IL-1和TNF-α含量明显升高(P<0.05),C、D组关节液中IL-1和TNF-α含量与B组相比有明显减少(P<0.05),治疗后C组IL-1、TNF-α含量与D组比较无显著差异(P>0.05)。结论羌归膝舒丸对兔膝关节骨性关节炎有防治作用,其机理可能是通过降低关节液中细胞炎性因子IL-1、TNF-α含量从而抑制软骨的破坏,延缓骨性关节炎的进展。
膝骨性关节炎 羌归膝舒丸 白细胞介素-1 肿瘤坏死因子
膝骨性关节炎(KOA)是一种慢性关节疾病,又称为增生性关节炎、肥大性关节炎、老年性关节炎、骨关节病、软骨软化性关节病等,属中医学“骨痹”范畴[1]。流行病学调查显示,膝骨性关节炎60岁以上患病率高达50%,而75岁以上人群中增至80%,且最终致残率达53%,随着人口的老龄化,这些数字还在上升[2]。
骨性关节炎的病理改变主要表现为关节软骨的退行性变和不同程度的滑膜炎症,炎性细胞因子作为生化信号,有刺激软骨细胞释放降解酶,加快病变进程的作用,是炎症反应的始动因素[3],且IL-1、TNF-α已被证实是OA发生中的关键炎性因子[4]。因此如能有效抑制关节液中IL-1、TNF-α等炎性细胞因子水平,将对本病产生积极的治疗作用。结合目前羌归膝舒丸(河南省洛阳正骨医院内部制剂)在临床上应用所取得的良好疗效[5-6],开展羌归膝舒丸防治膝骨性关节炎的实验研究,为早期干预膝骨性关节炎及治疗提供可靠的理论基础。
1.1 实验动物 42只成年健康6~8月龄新西兰大白兔(由山东鲁抗医药股份有限公司试验动物室提供,体质量2.0 kg左右雄性。动物合格证号:SCXK<鲁>2008-0002),于河南省洛阳正骨医院SPF实验室饲养,饲养环境:室温18~20℃,湿度65%~70%,1笼1只,自由进食颗粒状饲料及饮用自来水。
1.2 试药与仪器 羌归膝舒丸(河南省洛阳正骨医院内部制剂);生理盐水 (洛阳市制药厂,生产批号12111409,国药准字:H41022738);盐酸氨基葡萄糖(浙江诚意药业有限公司,生产批号:120901,国药准字:H20070173)。戊巴比妥钠(河南省洛阳正骨医院实验室提供);蒸馏水(河南省洛阳正骨医院实验室);IL-1酶联免疫分析试剂盒 (美国R&D公司由连云港市五交化生物有限公司代购,批号:E-EL-RB0013);TNF-α酶联免疫分析试剂盒(美国R&D公司由连云港市五交化生物有限公司代购,批号:E-EL-RB0011)。
1.3 造模与分组 取新西兰大白兔42只,先于实验室适应性饲养1周后,按体质量大小将其各自编号随后随机抽取11只纳入空白组(A组),剩余31只进行膝骨性关节炎动物模型的制作[7]。由同组人员共同协作,纱布浸湿乙醚将造模组兔子临时麻醉后,取兔右后肢,将踝关节至髋关节处兔毛剪短至0.5 cm长,牵拉右后膝,使其处于伸直位,先于外层缠绕一层石膏棉,后用管状石膏固定膝关节,固定范围约为踝关节以上2 cm至髋关节下1.5 cm处,绑定的石膏层数约为9层,待石膏硬化后,于石膏外层临时用细铁丝缠绕固定(不加压),可有效防止兔子咬噬,从造模当天开始计时,固定5周,期间密切关注如出现造模肢石膏松动、脱落或出现造模肢踝关节以下肿胀则将石膏立即卸掉重新石膏固定。固定5周后,随机从空白组以及模型组各抽取1只兔子处死以验证模型是否成功,将剩余30只造模后的兔子再次按随机数字表法分别分入模型组(B组)、羌归膝舒丸组(C组)以及盐酸氨基葡萄糖组(D组)。
1.4 给药方法 C组:予以与人等效剂量的羌归膝舒丸:依据使用说明,60 kg人类使用剂量为12 g/d,依据Meeh-Rubner公式A(体表面积m2)=K(系数)×W(体质量)2/3×10-4公式计算得出每只兔每天用药量约1.16 g,将药丸碾成粉末后,加入生理盐水,配置成10 mL悬浊液进行灌胃。D组:予以与人等效剂量的盐酸氨基葡萄糖:人每天使用剂量为1.5 g,同理换算得出兔每天使用剂量为约为0.15 g,取盐酸氨基葡萄糖0.15 g加入生理盐水配置成10 mL溶液进行灌胃。A、B组予以等容积的蒸馏水10 mL,所有组别均每日灌胃1次,所有组别均连续灌胃3周,灌胃时间均为每日早上9点。
1.5 标本采集与检测 于末次灌胃24 h后,将实验兔予以3%戊巴比妥钠溶液经耳缘静脉注射麻醉,将关节腔中液体尽量抽出,置入冻存管后放置于-20℃的普通冰箱中保存,分别按IL-1、TNF-α试剂盒说明书采用ELISA法测试关节液中IL-1、TNF-α含量。实验兔完成关节液抽取后,经耳缘静脉注入空气5 mL处死,逐层分离膝关节结构,切断前后交叉以及韧带组织,分离股骨髁,于髁上离断骨组织,保留整个髁部结构,置于4%甲醛溶液中,固定48 h后,将固定标本送至病理科,进行常规HE染色软骨切片制备。
1.6 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件处理。研究中计量资料满足正态性、方差齐性时采用单因素方差分析(LSD法),不满足时采用秩和检验,检验水准取α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 治疗前各组兔膝关节肉眼大体观察及病理切片观察 见图1,图2。正常组:行动自如,膝关节无肿胀畸形等,关节主被动活动不受限制,解剖膝关节后可见股骨髁部关节面光滑,平整,无裂隙以及缺损,关节轮廓清晰,关节面呈淡蓝色,色泽明亮,触感较硬,关节液清亮,量少(图1A)。模型组:拆除石膏后,活动明显跛行,关节主动被活动受限,解剖膝关节后可见股骨髁关节面粗糙,不平整,色泽明显发黄,内侧髁形态学改变明显,且部分软骨面有剥离现象出现,触感硬度较正常组降低,关节液量较正常组增多呈淡黄色,周围可见部分骨质硬化区(图1B)。治疗前病理切片观察:正常组软骨组织结构清晰,表层光滑,幼稚软骨细胞位于软骨组织的浅层,单个排列,呈扁圆形,长轴与软骨表面平行,成熟软骨位于深层,体积明显增大,为圆形或椭圆形,且团状聚集分布,基质染色正常、均匀(图2A)。模型组可见软骨表层纤维化,外观失去连续性,表面糜烂,可见明显不规则裂隙形成,表层幼稚软骨细胞数量明显减少,结构不清,有碎裂现象。染色变浅,成熟的软骨细胞数量亦减少,排列无明显规律(图2B)。由上对比可知模型组在肉眼观察层面以及病理切片观察上均与正常组有明显区别,因此可认为骨性关节炎模型是成功的。
图1 治疗前兔膝关节肉眼大体观察
图2 治疗前兔膝关节病理切片观察
2.2 治疗后各组兔膝关节肉眼大体观察及股骨髁软骨病理切片观察 见图3和图4。正常组:股骨髁部关节面光滑,平整,轮廓清晰,软骨面呈淡蓝色,色泽明亮,触感较硬(图3A)。模型组:关节面粗糙不平整,可见部分糜烂溃疡面,缺损深达软骨深层,色泽暗发黄,内侧髁形态学改变明显,部分软骨有剥离现象。关节周缘出现骨质增生区(图3B)。羌归膝舒丸组:关节软骨外观轮廓较清晰,软骨面色泽呈白色,触之硬度较正常组软,表面可见小面积糜烂,周缘可见少量骨赘增生(图3C)。盐酸氨基葡萄糖组:关节软骨外观轮廓较清晰,软骨面色泽呈白色,表面可见小面积糜烂,周缘可见少量骨赘增生,基本与羌归膝舒丸组相近。(图3D)。治疗后病理切片观察:正常组软骨组织结构清晰,表层光滑,幼稚软骨细胞位于软骨组织的浅层,单个排列,呈扁圆形,长轴与软骨表面平行,成熟软骨位于深层,体积明显增大,为圆形或椭圆形,且团状聚集分布,基质染色正常、均匀(图4A)。模型组软骨组织结构分层紊乱,不清晰,表层糜烂,全层软骨细胞数目均减少,以浅层幼稚软骨细胞为甚,基质染色变浅不均匀 (图4B)。羌归膝舒丸组软骨组织结构表层不光滑,有缺损以及裂隙,幼稚软骨细胞层消失,中间层细胞结构清晰,数目增多,可见及部分软骨细胞成簇出现,基质染色尚均匀(图4C)。盐酸氨基葡萄糖组:软骨组织结构表层不光滑,有缺损以及裂隙,幼稚软骨细胞层消失,表层明显纤维化,软骨细胞数目较正常组明显增多并可见部分软骨细胞成簇出现,基质染色尚均匀(图4D)。
图3 治疗后各组兔膝关节肉眼大体观察
图4 各组股骨髁软骨病理切片观察(HE染色,400倍)
2.3 各组兔关节液中IL-1、TNF-α含量比较 见表1。治疗后B、C、D组IL-1、TNF-α含量高于A组 (P<0.05),C、D组IL-1、TNF-α的含量低于B组(P<0.05),C、D组的IL-1、TNF-α的含量差异不明显(P>0.05)。
表1 各组兔关节液中IL-1、TNF-α含量比较(mg/L,s)
表1 各组兔关节液中IL-1、TNF-α含量比较(mg/L,s)
与A组比较,△P<0.05;与B组比较,▲P<0.05。
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膝骨性关节炎属中医学“痹证”范畴,其发病与肝、脾、肾三脏极为密切,本病多由机体内在肝肾不足、气血亏虚、脾虚失运;加之外在风寒湿气邪入侵、痰阻经络、外伤劳损等外在因素共同作用于骨骼而致病[8]。目前大多学者认为本病属本虚标实,肝肾亏虚为本,气滞血瘀痰凝、风寒外邪侵袭、痹阻经络为标,治疗上宜活血化瘀,兼补肝肾。羌归膝舒丸为洛阳平乐郭氏正骨经验方,由羌活、当归、赤芍、红花、乳香、没药、独活、牛膝、柴胡等10余味中药组成,本方由羌活胜湿汤加减演变而来,方中羌活祛风湿,滑利关节,止痹痛;当归、赤芍、红花活血化瘀,消肿止痛;牛膝滋补肝肾,引血下行;乳香、没药活血行气而止痛;柴胡疏肝解郁。全方具有散寒除湿、活血通经止痛、补肾疏肝的功效,对膝痹病有散寒通经、活血化瘀的功效[9-10]。诸药合用活血而不伤血,理气而不伤正,温通而不燥,祛瘀而能生新。
炎症反应中,IL-1可提高微血管的通透性并具有趋化作用,即使微血管通透性增高,又能提高中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞的趋化作用[11]。TNF-α能选择性地抑制软骨胶原产生,抑制蛋白聚糖合成,同时促其降解,与OA软骨破坏及滑膜炎有一定关系[12]。因此,抑制IL-1、TNF-α所造成的滑膜炎性反应及关节软骨的退变,成为防治OA的关键[13-14]。
通过实验发现,造模5周后B组关节液中IL-1、TNF-α的含量较A组明显增高,说明兔膝关节发生炎症性改变,这与切片中病理学表现一致,说明本次实验模型稳定可靠。C组治疗后IL-1、TNF-α含量较B组降低,且形态学较B组改善,说明羌归膝舒丸可能通过抑制兔膝关节积液中IL-1、TNF-α的含量,来降低炎症因子对关节软骨的破坏,为关节软骨的修复提供环境。D组在治疗后IL-1、TNF-α含量与C组无统计学差异,说明在治疗后,羌归膝舒丸可以达到与盐酸氨基葡萄糖类似的疗效[15-16]。
综上所述,羌归膝舒丸可能通过降低KOA发生环节中炎性细胞因子IL-1、TNF-α的含量,改善骨性关节炎实验动物膝关节解剖学形态以及软骨显微结构,因此可以认为该复方可对软骨细胞起到一定的保护以及修复作用,为羌归膝舒丸的临床作用提供一定的实验理论依据。由于羌归膝舒丸为复方,其中具体功用成分以及其对软骨保护的其他相关作用机制仍需进一步实验研究来完善。
[1] 胥少汀,葛宝丰,徐印坎.实用骨科学[M].4版.北京:人民军医出版社,2012:1676.
[2] 李宁化.中老年人群骨关节炎的流行病学特征[J].中国临床康复,2005,9(38):133-135.
[3] 陈巍,李彬,唐中尧,等.膝骨性关节炎患者关节滑液IL-1和TNF-α的表达及临床意义[J].广东医学,2010,31(15):1998-2000.
[4] 章寅,许丁锐,王峰,等.消瘀接骨散对兔膝骨关节炎模型关节液中IL-1、TNF-α、TGF-β1表达的影响[J].中医药临床杂志,2015,27(12):1726-1728.
[5] 田涛涛,李无阴.羌归膝舒丸治疗寒凝血瘀型膝骨关节炎60例[J].中国中医药现代远程教育,2013,11(2):9-10.
[6] 韩宗昌,王战朝,李无阴,等.羌归膝舒丸治疗膝骨关节炎的临床疗效及对IL-1β和TNF-α的影响[J].风湿病与关节炎,2015,4(7):22-24.
[7] O Ryuji,S Akinori,S Takeshi,et a1.Apoptosis and p53 expression in chondrocytes relate to degeneration in articular cartilage of immobilized knee joints[J].Journal of Rheumatology,2003,30(3):559-566.
[8] 黄云梅,陈文列,刘献详,等.透骨消痛颗粒对骨性关节炎影响的组织化学研究[J].中国中医骨伤科杂志,2011,19(1):1-3.
[9] 韩军涛,夏华玲,何广宏.羌归膝舒丸的质量标准研究[J].中医正骨,2005,17(10):77.
[10]吴一梦,高书图,刘又文,等.综合疗法治疗膝骨关节炎43例疗效观察[J].风湿病与关节炎,2014,3(11):36-38.
[11]胡建华,黄尚志.骨关节炎软骨细胞凋亡调控基因的研究[J].中华外科杂志,2000,38(4):266-268.
[12]MJ Lopez-Armada,B Carames,M Lires-Dean,et al.Cytokines,tumor necrosis factor-α and interleukin-1β,differentially regulate apoptosis in osteoarthritis cultured human chondrocytes[J].Osteoarthritis&Cartilage,2006,14(7):660-669.
[13]金凤羽.原发性膝骨性关节炎的非手术治疗[J].中国组织工程研究,2013,17(30):5531-5538.
[14]李赛波,吴耀持.膝骨性关节炎组织形态及细胞因子变化与中医药干预的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(7):1313-1317.
[15]李明辉,刘洋,王彩民,等.盐酸氨基葡萄糖联合塞来昔布治疗膝骨性关节炎的随机对照[J].中国组织工程研究,2013,17(43):7654-7660.
[16]刘建业.盐酸氛基简萄糖联合姜黄素对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响[D].郑州:郑州大学,2014.
Influence of Qianggui Xishu Recipe on Level of IL-1,TNF-α in Synovial Fluid of Knee Osteoarthritis Model Rabbits
CHAI Xubin,ZHOU Yingjie. Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province,Henan,Luoyang 471002,China.
Objective:To explore the efficacy of Qianggui Xishu recipe in the treatment of the knee osteoarthritis by observing the effects of Electroacupuncture on cell factors IL-1and TNF-α.Methods:11 rabbits were picked among 42 New Zealand rabbits randomly as normal group(A group).The rest as the model group was managed by the plaster immobilication with right posterior knee joint in extend excessive position.Then1 rabbit was picked randomly and executed from A group and model group to prove the model was successful after 5 weeks.Then the plaster was removed in the model group.The 10 rabbits left without modeling were taken as the normal group.The rest 30 modeled rabbits were randomly divided into 3 groups:B(model group),C(Qianggui Xishu recipe),and D(Glucosamine hydrochloride).Group A-B were received 10 mL normal saline once daily. Group C were treated with QGXS recipe 1.16g once daily,group D with 0.15g Glucosamine hydrochloride once daily.All rabbits were executed after being treated for 3 weeks.The general condition of articular cartilage was observed with eye and microscope.The expression of transforming growth IL-1 and TNF-α in articular cartilage was detected by ELISA method.Results:1)The articular cartilage was degenerative of the rabbit in model control group.2)There were more or less degenerative changes of OA in group B,C,and D group by eye and microscope. No degenerative changes occurred in group A.The group B changed more seriously than C-D group.3)After the treatment of 3 weeks,the content of IL-1 and TNF-α of B,C,D groups were higher than that of A group.The differences were statistically significant(P<0.05).The content of IL-1 and TNF-α of C and D groups were higherthan that of B group.The differences were statistically significant(P<0.05).The content of IL-1 and TNF-α of C group were more than that of D group.But there were no obvious differences between group D and group C(P>0.05).Conclusion:The method of plaster immobilization with the knee joint in extend excessive position can successfully induce the model of KOA.The Qianggui Xishu recipe has the preventive and curative effects on Osteoarthritis by reducing IL-1 and TNF-α in the knee joint liquid to inhibit cartilage destruction and delay the progress of osteoarthritis.
Knee osteoarthritis;Qianggui Xishu recipe;Interlenkin-1;Tumor necrosis Factor-α
R285.5
A
1004-745X(2017)03-0401-04
10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.008
2016-12-14)
河南省重点中医学科学术带头人基金培养项目(2100601)
△通信作者(电子邮箱:1099168230@qq.com)