蜂胶黄酮的乙醇分级提取及其抗氧化活性比较

姜红宇JIANG Hong-yu 盘 雪 李目武 - 王宗成,2 -,2

(1. 湖南科技学院湖南省银杏工程技术研究中心，湖南 永州 425100；2. 中南大学化学化工学院, 湖南 长沙 410083)

蜂胶是蜜蜂用于维持整个群体健康的有效物质，一个5～6万只的蜂群一年只能生产蜂胶70～110 g，被誉为“紫色黄金”[1]。蜂胶主要有黄酮类化合物、萜类化合物、酚类化合物、有机酸类化合物、醛与酮类化合物、酯与醇类化合物等[2-4]。蜂胶被称为“黄酮类化合物的宝库”[5]，蜂胶黄酮类化合物与蜂胶的大部分生理及药理学活性，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗高血压、降血糖、增强免疫力、抗癌、促进细胞再生、美容养颜、镇痛等作用密切相关[6-9]。因此，关于蜂胶黄酮提取分离的研究颇多[10-13]。付英娟[11]采用不同溶剂对陕西产蜂胶进行了黄酮提取，其最佳超声波辅助提取条件为乙醇浓度79.51%，提取时间19.31 min，提取功率538.28 W，液料比39.48∶1；马士巧等[12]采用不同极性溶剂提取东北黑蜂胶中的活性成分，并研究了其抗氧化活性，发现用甲醇和乙醇提取得到的黄酮、多酚和三萜都较高，且抗氧化活性也都较强；张云香等[13]采用水和3个不同浓度的乙醇溶液对泰山产蜂胶进行黄酮提取，发现70%乙醇提取效果最好。然而，这些研究都是采用一种特定的溶剂进行提取，未见分级提取的研究和不同蜂胶黄酮活性物质的极性大小与活性强弱间关系的研究。为了筛查永州粗蜂胶中活性成分的极性差异以及根据活性强弱选择合适方法提取分离高活性的蜂胶黄酮，本研究在前人研究的基础上，选择水和9个不同浓度的乙醇分级提取永州粗蜂胶中的活性成分，以黄酮含量为指标，比较不同提取条件下蜂胶黄酮含量及其抗氧化活性的差异，通过不同溶剂提取的永州粗蜂胶中黄酮质量、含量和抗氧化活性差异分析永州粗蜂胶中黄酮性质，以期为蜂胶黄酮开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

1.1.1 原料与试剂

粗蜂胶：产地湖南永州，冷冻24 h后粉碎，过20目筛，置干燥箱中备用；

芦丁标准品：98.0%，北京方程生物科技有限公司；

乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：分析纯，天津市福晨化学试剂厂。

1.1.2 仪器设备

电子天平：TE124S型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

分光光度计：UV2800S型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE-201D型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 参照文献[14]，配置0.1 mg/mL芦丁标准溶液，以不加入芦丁标准溶液为空白对照，在λ=510 nm处分别测定0.01～0.06 mg/mL芦丁标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为：A=16.853C+0.040 2，R2=0.996 7，说明具有良好的线性关系。

1.2.2 蜂胶黄酮的分级提取与含量测定 精密称取10.00 g 粗蜂胶于250 mL平底烧瓶中，按1∶20(g/mL)的料液比加入蒸馏水，置于集热式磁力搅拌器中70 ℃提取1 h后，取出平底烧瓶，趁热倒入烧杯中用保鲜膜密封，置于阴凉处24 h[13]。样品分为3层，上层为蜂蜡，中间为水提取液，下层为处理后蜂胶。用玻璃棒将上层蜂蜡取出，在25 ℃烘箱中烘干并进行称重。将水提取液转移到已经称重的平底烧瓶中，于60 ℃下减压浓缩除去溶剂，再于25 ℃烘箱中烘干，称重作为样品1。

将下层处理后蜂胶用20%的乙醇溶液转移至已经称重的平底烧瓶中，乙醇溶液用量为处理后蜂胶的1∶20(g/mL)，70 ℃回流提取1 h后取出，用保鲜膜密封，沉降后分为2层，上层为乙醇提取液，下层为处理后蜂胶。将上层乙醇提取液转移到已经称重的平底烧瓶中，于60 ℃下减压浓缩除去溶剂，再于25 ℃烘箱中烘干，称重作为样品2。同理，分别用30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液和无水乙醇，制备样品3、样品4、样品5、样品6、样品7、样品8、样品9和样品10。提取完10个样品后，原平底烧瓶中残余物在25 ℃烘箱中烘干并进行称重。

将样品1～10号，分别溶于50%乙醇中，并定容至100 mL，从中取出5 mL用50%乙醇稀释至50 mL，作为样品溶液测定吸光度，依据回归方程计算黄酮含量。测定后，发现样品8～10号，由于浓度过低，直接取非稀释液测定吸光度，计算黄酮含量。

1.2.3 蜂胶黄酮的抗氧化活性测定

(1) 还原能力：参照文献[15]。

(2) 清除DPPH自由基能力：参照文献[16]。

(3) 清除ABTS自由基能力：参照文献[17]。

2 结果与分析

2.1 不同样品的蜂胶黄酮的乙醇分级提取试验结果

由表1可知，蜂胶在水中析出蜂蜡后，在水中的溶解量最少，随着乙醇浓度的升高，溶解量先增大后减少，在50%的乙醇中溶解质量最多(14.52%)，整个分级提取过程中，累积溶解百分数(除去蜂蜡)达到76.75%，说明永州粗蜂胶在水和乙醇中可溶性成分非常高，且蜂蜡含量较低，为13.37%。

由表1可知，水提取液中提取到的黄酮质量比20%和30%乙醇提取液中的略高，随着乙醇浓度的升高，提取到的黄酮质量先增加后减少，在50%乙醇提取液中得到的黄酮质量最高，随后减少，说明黄酮基本提取完全。在水提取、40%乙醇提取、50%乙醇提取和60%乙醇提取过程中得到的黄酮含量较高，分别为59.9%，41.8%，50.8%，63.4%，说明永州粗蜂胶中含有一些水溶性黄酮，因此水提取得到的蜂胶黄酮质量和含量较高，与马士巧等[12]报道的东北黑蜂胶水提物中总酚含量高、黄酮含量低，以及张云香[13]报道的泰山蜂胶水提黄酮含量较低还是有差异的。另外，在40%～60%乙醇提取过程中得到的蜂胶黄酮质量和含量较高，含有大量中等极性的黄酮。整个分级提取过程中，累积提取得到的黄酮达到2.66 g，提取到的总蜂胶黄酮占全部提取物的34.64%，但是80%乙醇、90%乙醇和无水乙醇提取得到的黄酮质量较少，杂质较多，从成本上考虑得到的提取物可以舍弃，将其他提取物合并计算，得到的黄酮可达2.58 g，提取到的蜂胶黄酮占提取物中的含量可达到41.18%，此时所得提取物中蜂胶黄酮含量明显高于梁巧楣[18]报道用70%乙醇冷浸再乙酸乙酯萃取湖南衡阳产蜂胶得到的蜂胶浸膏中黄酮含量(30.7%)。整个分级提取过程中，从粗蜂胶中累积提取得到的黄酮得率为26.59%，从数据可知用水、20%～70%乙醇从粗蜂胶提取得到的黄酮得率较高，用80%乙醇、90%乙醇和无水乙醇提取黄酮得率较低，从成本上考虑后者得到的提取物可以舍弃，此时黄酮得率可达到25.81%，明显高于安砚波等[19]报道用72.48% 乙醇超声辅助提取山东产蜂胶的得率(13.07%)。说明采用乙醇分级提取法提取永州粗蜂胶黄酮具有较好的提取分离效果，得到的蜂胶黄酮纯度较高、得率较高。

2.2 蜂胶黄酮的抗氧化活性

2.2.1 还原能力 由表2可知，随蜂胶黄酮浓度和VC浓度的增加，还原能力增强，呈现量效关系，其中50%乙醇提取和60%乙醇提取黄酮还原能力较强，且显著高于VC(P<0.05)；水提取黄酮、40%乙醇提取黄酮、70%乙醇提取黄酮比VC还原能力稍弱；30%乙醇提取黄酮还原能力最差。说明粗蜂胶中含有不同类型的蜂胶黄酮，提取活性较高的蜂胶黄酮，可以选择水提取水溶性黄酮，还可以选择40%～70%乙醇提取中等极性黄酮；80%、90%乙醇和无水乙醇提取的黄酮还原能力相近且较差。

2.2.2 清除DPPH自由基能力 由表3可知，随蜂胶黄酮浓度和VC浓度的增加，清除DPPH自由基能力增强，呈现量效关系；50%乙醇提取和60%乙醇提取的黄酮清除DPPH自由基的能力显著性高于VC的(P<0.05)，且50%乙醇提取的黄酮清除DPPH自由基能力最强；70%乙醇提取的黄酮和VC清除DPPH自由基能力相差不大；水提取的黄酮、40%乙醇提取黄酮比VC清除DPPH自由基能力稍弱；30%乙醇提取的黄酮清除DPPH自由基能力最差。说明粗蜂胶中含有不同类型的蜂胶黄酮，提取活性较高的蜂胶黄酮，可以选择水提取水溶性黄酮，还可以选择40%～70%乙醇提取中等极性黄酮；80%乙醇、90%乙醇和无水乙醇提取的黄酮清除DPPH自由基能力相近且较差。

2.2.3 清除ABTS自由基能力 由表4可知，随蜂胶黄酮浓度和Vc浓度的增加，清除ABTS自由基能力增强，且呈现量效关系；50%乙醇提取的黄酮清除ABTS自由基的能力显著高于VC的(P<0.05)；水提取的、40%乙醇提取、60%乙醇提取的和70%乙醇提取的黄酮清除ABTS自由基的能力与VC的相近；30%乙醇提取的黄酮清除ABTS自由基能力最差。说明粗蜂胶中含有不同类型的蜂胶黄酮，提取活性较高的蜂胶黄酮，可以选择水提取水溶性黄酮，还可以选择40%～70%乙醇提取中等极性黄酮；80%乙醇、90%乙醇和无水乙醇提取的黄酮清除ABTS自由基能力相近且较差。

† a：水提取过程中上层析出的蜂蜡质量；b：不含蜂蜡的溶解质量；c：乙醇分级提取到的总蜂胶黄酮占全部提取物中的含量。

† 同列中不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。

† 同列中不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。

† 同列中不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。

3 结论

采用乙醇分级提取永州粗蜂胶能得到纯度较高、得率较高的蜂胶黄酮，提取物中蜂胶黄酮的含量可达到41.2%，黄酮得率可达到25.81%，且可以按照极性大小进行分离，说明乙醇分级提取分离粗蜂胶黄酮具有可行性，且永州粗蜂胶中不但含有大量中等极性黄酮，还含有较多水溶性黄酮。但是分级提取前用热水溶解蜂蜡，并冷却析出除去了这部分不含黄酮的成分，蜂蜡是否具有辅助药效活性，还有待进一步研究。

乙醇分级提取的不同蜂胶黄酮的抗氧化活性具有明显差异，且随蜂胶黄酮浓度的增加，抗氧化活性增强，呈现明显的量效关系。说明永州粗蜂胶中含有不同类型的蜂胶黄酮，提取活性较高的蜂胶黄酮，可以选择水提取水溶性黄酮和40%～70%乙醇提取中等极性黄酮。由于不同地区蜂胶的抗氧化活性差异较大[20]，且未见乙醇分级提取得到的不同蜂胶黄酮样品的抗氧化活性差异报道，与其他文献抗氧化活性没有较好的可比性，此外黄酮类物质只是衡量物质抗氧化活性的一个指标，能不能将黄酮类物质含量作为唯一衡量抗氧化的指标，值得进一步研究。

乙醇分级提取获得的不同蜂胶黄酮样品中黄酮质量、含量与抗氧化活性之间有一定的相关性，说明乙醇分级提取蜂胶黄酮从提取效果、分离效果和抗氧化活性上都具有一定优势。

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