HPLC-ICP-MS法测定水产动物及其制品中5种砷形态的含量

王林裴WANG Lin-pei 郑亚哲 - 彭新然 -

(1. 漯河出入境检验检疫局，河南 漯河 462000；2. 启迪桑德环境资源股份有限公司，北京 101102)

砷在自然界中广泛存在，在地壳所含元素的丰度中排第54位[1]。随着工业的快速发展，包括矿业开采、化石燃料燃烧等人为活动，大量的砷进入到环境中，造成严重的砷污染问题[2]。砷主要以4种价态(-Ⅲ、0、Ⅲ、Ⅴ)存在，在生物地球化学循环过程以及在生物体内发生甲基化等过程，其化学形态发生了一系列变化[3]，主要以无机态的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，有机态的一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷甜菜碱(AsB)和砷胆碱(AsC)形式存在[4]。

不同形态的砷其环境毒理学性质相差迥异，无机砷毒性高于有机砷，目前国内外仅对水产动物及其制品中无机砷限量作出规定，但有研究[5]表明，有些有机砷可能与癌细胞活性有关，也具有一定的毒性。砷总量的测定已经不能够客观地对砷化合物的安全性作出评价[6]。经过多年的发展研究，国内外主要采用联用方法对砷形态进行检测分析。用砷元素特征检测器如AAS(原子吸收光谱仪)[7-8]、AFS(原子荧光光谱仪)[9-10]、ICP-AES(电感耦合等离子体发射光谱仪)[11]、ICP-MS(电感耦合等离子体质谱仪)[12-14]等与色谱等分离手段联用，从而将不同形态的砷检测出来[15]。气相色谱(GC)较适用于易挥发或中等挥发的有机金属化合物的分离，而且分离之前的衍生化步骤不仅使分离、分析过程复杂化，而且增加了待测元素形态丢失或玷污的可能性、毛细管电泳(CE)[16]分离效率高，操作条件温和，但在分离过程中，样品在分析中的原始形态可能由于电解质或pH的调节而发生变化，样品的组成也会对CE分离造成一定影响，且CE与ICP-MS的对接问题不如ICP-MS成熟。

液相色谱因其极佳的分离能力和ICP-MS的高灵敏度，可采用阴离子交换柱来分离不同形态的砷、用ICP-MS检测[17]。由于水产动物及其制品中有机砷通常含量较高，尤其是砷甜菜碱，此种形态砷不易与三价砷完全分离。本试验采用微波消解的方法对样品进行前处理，并且对微波消解条件进行优化,以选择对各种砷形态进行充分提取的最佳温度；采用Hanmilton PRX-X100阴离子色谱柱进行分离，并对色谱条件进行优化，使有机砷与无机砷完全分离，以避免各种砷形态检测的影响，从而建立一种新型的快速有效分离检测砷形态的方法，为相关食品的监管检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚砷酸盐[As(Ⅲ)]标准品：GBW 08666，(75.7±1.2) μg/g，国家标准物质研究中心；

砷酸盐[As(Ⅴ)]标准品：GBW 08667，(17.5±0.4) μg/g，国家标准物质研究中心；

一甲基砷(MMA)标准品：GBW 08668，(25.1±0.8) μg/g，国家标准物质研究中心；

二甲基砷(DMA)标准品：GBW 08669，(52.9±1.8) μg/g，国家标准物质研究中心；

砷甜菜碱(AsB)的标准品：GBW 08670，(38.8±1.1) μg/g，国家标准物质研究中心；

调谐溶液：500 ng/mL Li、 Co、Yi、Ce、Tl混合标准溶液，2% 硝酸介质，美国安捷伦科技有限公司；

乙醇：优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

氨水、乙二胺四乙酸、磷酸二氢铵：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

硝酸：优级纯，北京化工厂；

试验室用水：由Milli-Q Advantage A10系统制备的高纯水，所用容器使用前均用25% HNO3溶液浸泡过夜。

1.2 仪器与设备

电感耦合等离子体质谱仪：Agilent 7700x型，美国安捷伦科技有限公司；

高效液相色谱仪：Agilent 1260系列，四元梯度泵，美国安捷伦科技有限公司；

超纯水器：Mill-Q Advantage A10系统，美国Millipore科技有限公司；

超声清洗器：KQ5200DE型，中国昆山仪器有限公司；

恒温水浴振荡器：SHZ-88型，江苏省金坛市医疗仪器厂；

酸度计：PHS-3C型，上海雷磁仪电科学仪器股份有限公司；

分析天平：精度为0.001 g，XPE205型，瑞士梅特勒-托利多科技有限公司；

微波消解仪：CEM MARS 6 ONETOUCH型，美国CEM公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 硝酸溶液(0.15 mol/L) 量取10 mL硝酸，溶于水并稀释至1 000 mL。

1.3.2 流动相 流动相A(25 mmol/L NH4H2PO4溶液)：称取磷酸二氢铵2.876 g，用水溶解，并定容到1 000 mL容量瓶，用氨水调节pH到8.0，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气30 min；流动相B为乙醇。

1.3.3 亚砷酸盐 [As(Ⅲ)]标准储备液(10 μg/mL，以As计) 称取0.132 g，用水稀释定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.4 砷酸盐 [As(Ⅴ)]标准储备液(10 μg/mL，以As计)

称取0.571 4 g，用水稀释定容至10 mL，避光保存在4 ℃ 冰箱中。

1.3.5 一甲基砷(MMA)标准储备液(10 μg/mL，以As计)

称取0.398 g，用水稀释定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.6 二甲基砷(DMA)标准储备液(10 μg/mL，以As计)

称取0.198 g，用水稀释定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.7 砷甜菜碱(AsB)标准溶液储备液(10 μg/mL，以As计) 称取0.257 g，用水稀释定容至10 mL，避光保存在4 ℃冰箱中。

1.3.8 混合标准使用液(1.0 μg/mL) 准确移取亚砷酸盐 [As(Ⅲ)]、砷酸盐 [As(Ⅴ)]、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)和砷甜菜碱(AsB)5种标准储备液各0.1 mL，用水稀释定容至10 mL。

1.3.9 混合标准工作液 分别移取混合标准使用液0.0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mL于一组10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，得到以上5种砷形态的浓度分别0，10，20，40，80，100 μg/L的混合标准工作液。

1.4 试验方法

1.4.1 仪器条件

(1) ICP-MS工作条件：功率1 550 W，玻璃同心雾化器，石英雾化室，半导体控温于(2±0.1) ℃，石英矩管，2.5 mm 中心通道，屏蔽矩，Pt采样锥和截取锥，载气流量：1.02 mL/min，补偿气0.15 mL/min，采样深度：7.5 mm，采集质量数：砷75，氯35；分析时间10 min，峰面积定量载气(氩气)纯度≥99.99%。

(2) 色谱条件：色谱柱为Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流动相A(25 mmol/L NH4H2PO4溶液，pH 8.0)∶B(乙醇)=99∶1(体积比)，流速1.0 mL/min；进样量50 μL，柱温25 ℃。

1.4.2 样品前处理 将样品混匀打碎后称取1.0 g(精确至0.001 g)左右，置于微波消解罐中，加入20 mL 0.15 mol/L的硝酸溶液，设置微波辅助条件，在80 ℃提取30 min。待处理完毕后，取出冷却至室温。经萃取后将所得溶液于8 000 r/min 离心15 min，取5 mL上清液至离心管中，加5 mL 正己烷，振摇1 min后，8 000 r/min离心15 min，弃去上层正己烷，此过程重复1次。吸取下层清液用0.45 μm 有机滤膜过滤及Bond Elut C18柱净化后进样，按相同方法作样品空白。

1.5 砷形态含量的计算

试样中的砷形态含量按式(1)计算：

(1)

式中：

X——试样中不同砷形态的含量，mg/kg；

f——稀释因子；

c——测定液中不同的砷形态的质量浓度，μg/L；

co——空白溶液中不同砷形态的浓度，μg/L；

V——加入提取剂的体积，mL；

1 000——换算系数；

m——称样量，g。

1.6 试验条件的优化

1.6.1 色谱条件的优化 由于流动相对砷形态的分离效果影响程度较大，因此试验通过控制变量法，研究流动相洗脱方式、流动相A(pH 8.0的25 mmol/L NH4H2PO4溶液)和B(乙醇)的比例、流动相的pH等因素对分离度的影响，进而优化出分离效果较好的色谱条件。

(1) 洗脱方式的选择：色谱柱为Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，选择已优化好的流动相A的pH(A与B体积比为99∶1)，流速1.0 mL/min；进样量50 μL，柱温25 ℃，ICP-MS工作条件如1.3.2，采用等度和梯度洗脱2种方式，梯度洗脱程序见表1。比较5种不同砷形态的分离效果。

(2) 流动相pH的选择：色谱柱为Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流速1.0 mL/min；进样量50 μL，柱温25 ℃，ICP-MS工作条件如1.3.2，配制不同pH的流动相A(A与B体积比为99∶1)，pH分别为6.57，8.00，8.57，进样，观察分离效果进而优化选择。

(3) 流动相A、B比例的优化：色谱柱为Hanmilton PRX-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)，流速1.0 mL/min；进样量50 μL，柱温25 ℃，ICP-MS工作条件如1.3.2，流动相A与B的体积比分别为 80∶20，90∶10，95∶5，99∶1，观察分离效果以选择最优比例。

1.6.2 提取温度的优化 保持试验条件(包括色谱条件和ICP-MS工作条件)均相同，考察了不同温度(50，60，70，80，90，100 ℃)对5种砷形态提取效率的影响。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 洗脱方式的选择 由于水产动物中含有较高浓度的无机砷，因此选用阴离子交换色谱柱、洗脱能力较强的磷酸盐缓冲体系，试验比较了等度洗脱和梯度洗脱不同方式对5种砷形态的分离效果。由图1可知，2种方式均可有效分离5种砷形态，但是梯度洗脱时间较长，与等度洗脱分离效果无明显差别，而等度洗脱较为方便并且可以缩短分离时间，在8 min 内能够实现5种砷形态的分离且效果较好。因此选用等度洗脱方式。

Figure 1 The effect of different eluting methods on the separation effect of 5 types of arsenic

2.1.2 流动相的优化 预试验发现，加入EDTA与否对出峰效果及峰型无明显影响。因此，不在流动相中加入EDTA。

(1) 流动相pH值对分离度的影响：流动相pH值的变化对5种砷形态的保留时间影响较大。由图2可知，当pH为6.57和8.71时均不能正常出峰；而pH为8.00时，5种砷形态均可正常出峰，且保留时间较短；pH为8.71时，As(Ⅴ)的保留时间增加，且AsB与As(Ⅲ)无法分离。因此选择最佳pH为8.00。

(2) 流动相A与B比例的选择：据报道[18]，加入适量的有机相可以提高ICP-MS对砷检测的灵敏度，但加入有机溶剂过多，会使矩管及锥孔积炭效应严重，反而降低仪器灵敏度。由图3可知，随着有机溶剂比例的减小，5种砷形态的保留时间逐渐减小，As(Ⅴ)的保留时间由A与B体积比为80∶20 时的9.37 min减小到A与B体积比为99∶1时的7.98 min，同时也能保持较高的灵敏度。因此，考虑选择流动相A与B体积比为99∶1。

2.2 提取温度的选择

由于温度对5种砷形态的提取效率影响较大，其中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)还会在一定条件下会发生转化，而有机砷形态稳定性较好，因此考察了温度对5种砷形态的提取效果的影响。试验中以0.15 mol/L硝酸水溶液为提取剂，提取时间设为30 min，分别设置不同温度对5种砷形态进行提取，结果见表2。对于DMA、MMA 2种砷形态来说，随着温度的增加，提取效率逐渐增加，但80 ℃以后增加幅度减小，AsB的提取效率受温度影响较小。As(Ⅲ)在温度高于80 ℃后易转化，使提取效率降低，而As(Ⅴ)在80 ℃以后提取效率有所增加，可能是由于过高的温度使得As(Ⅲ)发生了某种程度的转化，而总砷也是随着温度升高，提取效率增加，但是当温度>80 ℃以后增加幅度不大，说明80 ℃以后大部分的砷形态提取得较为完全，无需在更高温度条件下进行提取。综合考虑，选择80 ℃为最佳提取温度。

2.3 方法的线性范围及检出限

分别配制0～100 μg/L的5种砷形态化合物混合标准系列溶液，在优化好的色谱条件及ICP-MS工作条件下进行分析，浓度梯度在0～100 μg/L时，相关系数r均在0.999 0以上。采用逐级稀释法，在0.1 μg/L时As(Ⅲ)的信噪比(S/N)≥3；在0.4 μg/L时As(Ⅴ)的信噪比(S/N)≥3；在0.15 μg/L时MMA的信噪比(S/N)≥3；在0.15 μg/L时DMA的信噪比(S/N)≥3；在0.5 μg/L时AsB的信噪比(S/N)≥3；由此确定5种砷形态化合物的检出限分别为0.1～0.5 μg/L；称样量为1.0 g，定容体积为20 mL，5种砷形态的最低检出浓度、定量限(以S/N≥10确定方法定量限)等数据见表3。由表3可知，5种砷形态的最低检出浓度为0.002～0.010 mg/kg，定量限为0.007～0.010 mg/kg。

2.4 精密度试验

为检验方法的精密度，选择浓度为10 μg/L的5种形态砷的混合标准溶液连续平行测定6次，其相对标准偏差分别为1.5%，3.3%，4.5%，4.5%，2.9%，精密度良好，结果见表4。

†X表示标准溶液的质量浓度，ng/mL；Y为仪器响应值。

2.5 加标回收试验

准确称取相同质量(1.000 g左右)的已搅碎虾肉组织，并向其中加入3种浓度水平(分别为5，20，80 μg/L)的5种砷形态的混合标准溶液，用1.3所述方法进行样品前处理，在已优化好的色谱条件和ICP-MS工作条件下进行测定，平行进样3次，计算平均回收率，见表5。由表5可知，加标浓度为5 μg/L时，回收率为87.8%～97.5%；加标浓度为20 μg/L时，回收率为91.0%～95.5%；加标浓度为80 μg/L时，回收率为92.3%～95.6%，均满足GB/T 27404—2008标准的要求(80%～110%)。

2.6 方法准确度验证

采用有证标准物质金枪鱼肉组织BCR 627，考察方法准确度。由表6可知，本方法对金枪鱼肉组织标准物质中砷形态测定结果能与标准参考值保持一致。说明该方法准确度较高，结果稳定可靠。

2.7 实际样品测定

† N.D表示未检出。

抽取漯河市市售13种水产动物及其制品各6批次，根据优化后的仪器条件和样品处理方法分别对其进行5种砷形态含量的检测，见表7。由表7可知，在不同种类的水产动物样品及其制品中，有机砷含量较高，无机砷[As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和]含量较低，大部分在0.005～0.063 mg/kg，均符合GB 2762—2012中污染物限量的规定(鱼类及其制品中无机砷的限量不超过0.1 mg/kg，其他水产动物及其制品中无机砷含量不超过0.5 mg/kg)。

† N.D表示未检出。

3 结论

本研究建立了用20 mL 0.15 mol/L硝酸水溶液微波消解的前处理方法提取样品中的砷形态，Agilent 1260 Infinity LC与Agilent 7700x ICP-MS联用技术分离测定水产动物及其制品中的5种砷形态。与GB 5009.17—2014中所述的测定无机砷的前处理方法相比，该法简单、测定周期短，采用He模式下的碰撞反应池可以消除Cl对As的潜在干扰，稳定性好，同时具有较高的灵敏度；采用磷酸盐缓冲液作为流动相，Hanmilton PRX-X100阴离子色谱柱作为分析柱，通过对色谱条件进行优化，也可以使5种砷形态达到良好的分离效果，检出限较低，精密度高；该方法在砷质量浓度为0～100 μg/L 时呈现良好的线性关系，5种形态砷的相关系数均在0.999 0以上；通过对有证标准物质金枪鱼鱼肉组织BCR 627进行测定及加标回收试验验证了此方法的准确度，因此本研究所建立的方法适用于快速测定水产动物及其制品中的砷形态。

但是，由于砷有多种存在形态，本试验只研究了砷酸根[As(Ⅴ)]、亚砷酸根[As(Ⅲ)]、砷甜菜碱AsB、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)5种砷形态的分离检测效果，而砷胆碱(AsC)、洛克沙砷(ROX)、4-羟基苯砷酸(4-HPAA)、4-硝基苯砷酸(4-NPAA)等有机砷常作为饲料添加剂使用，能够提高饲料转化率、提高产蛋量，但是仍具有一定的毒性，过量添加会使动物中枢神经系统失调，促使脑病和视神经萎缩的发病率升高；若这些有毒性的有机砷在动物体内代谢过程中残留或降解为其他砷形态化合物，对动物造成损害的同时，也会经过食物链进入到人体，从而威胁人体健康。因此，同时分离、测定多种砷形态的简单高效方法仍需进一步开发。

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