山皂荚多糖的提取工艺及抑菌活性

高 洁董文宾 王 勇 王 燕

(1. 陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 712046；2. 陕西科技大学，陕西 西安 710000；3. 陕西省食品加工工程技术研究中心，陕西 西安 710000；4. 陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710000)

山皂荚多糖的提取工艺及抑菌活性

高 洁1董文宾2,3王 勇4王 燕1

(1. 陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 712046；2. 陕西科技大学，陕西 西安 710000；3. 陕西省食品加工工程技术研究中心，陕西 西安 710000；4. 陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710000)

以山皂荚多糖为研究对象，在单因素的基础上，以液固比、提取时间、提取温度作为主要影响因素，使用响应面设计法优化了山皂荚多糖的提取工艺，并使用滤纸片扩散法对所提多糖进行抑菌活性试验。结果表明：山皂荚多糖的最佳提取工艺为：液固比50∶1(mL/g)，提取温度65 ℃，提取时间80 min，山皂荚多糖的得率可达(31.52±0.54)%；山皂荚多糖溶液浓度为100 mg/mL时，对细菌的抑菌效果为：沙门氏菌<大肠杆菌<蜡样芽孢杆菌<枯草芽孢杆菌<金黄色葡萄球菌，山皂荚多糖抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌的最小抑菌浓度分别为25，50，50，25，50 mg/mL。

山皂荚；多糖；抑菌活性

皂荚(GleditsiasinensisLam. )系豆科苏木亚科(或云实亚科)的多年生木本植物。皂荚中主要含有鞣质、酚性物质、生物碱、有机酸、糖类、油脂等化学成分[1]，其具有抗菌[2-3]、杀虫[4]、抗病毒[5]、免疫调节[6]等功效，现有的皂荚成分研究多集中在皂苷上，而皂荚中多糖的含量远大于皂苷，皂荚多糖药用价值较高，可提高免疫力[7]、保肝护肝[8-9]、抗菌消炎[10]等。

植物多糖的分离提取方法较多，主要有酶提取法、微波辅助法、超声波提取法等[11]，它们虽优点较多，但有机溶剂使用量大，条件不易控制，且影响因素较多。而水提法相比其他提取方法具有便捷、经济、适合量化生产等特点。本研究拟采用水提取法提取山皂荚多糖，在单因素试验的基础上，采用响应曲面法对提取条件进行优化，并研究不同浓度的山皂荚多糖对5种细菌的抑菌效果，旨在为皂荚资源的有效利用及工业化生产提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

山皂荚：采摘于陕西省安康宁陕县旬阳坝镇平河梁，经陕西中医药大学雷国莲教授鉴定为山皂荚Gleditsiajaponic.miq；

无水乙醇：分析纯，西安福晨化学试剂有限公司；

其他试剂均为分析纯；

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽胞杆菌(Bacilluscereus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(S.typhimurium)：陕西科技大学生物工程实验教学中心；

牛肉膏-蛋白胨琼脂培养基[12-13]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，氯化钠5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.2 主要仪器设备

真空干燥箱：DZF-6020型，上海赫田科学仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：HH-M4型，上海赫田科学仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

循环水多用真空泵：SHZ-D(III) 型，郑州长城工贸有限公司；

离心机：TGL-16B型，上海安亭科学仪器厂；

紫外可见分光光度计：TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；

压力蒸气灭菌锅：YXQ-LS-100A型，济南捷岛分析仪器有限公司；

电热恒温培养箱：HT-350B型，上海赫田科学仪器有限公司；

透析袋：MD25(8 000-14 000)型，上海欧韦达仪器科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 山皂荚多糖的制备 取去籽后的山皂荚荚果，粉碎过5号筛，干燥后得皂荚粉末。用天平称取5 g，加入体积分数为80%的乙醇，浸制预处理10 h，旋转蒸发仪内蒸出乙醇，残留液乙醇洗涤后进行干燥，得预处理山皂荚干粉。称量山皂荚干粉5 g，蒸馏水回流提取2次，合并滤液，纱布过滤，滤液离心(3 000 r/min，10 min)去残渣，收集滤液，3倍无水乙醇沉淀，脱水干燥，得山皂荚粗多糖。

山皂荚粗多糖采用sevag法除蛋白[14-15]，称取一定量的山皂荚粗多糖，蒸馏水溶解后加入1/5体积的sevag试剂，分液漏斗中混合均匀，除去蛋白层，取脱蛋白后的多糖溶液进行H2O2脱色，将脱色后的多糖溶液置于透析袋中，3 h换一次水，透析24 h，透析后的多糖溶液加入3倍乙醇，4 ℃沉淀过夜，离心(4 000 r/min，10 min)除清液，沉淀干燥至恒重得山皂荚精多糖。

(1)

式中：

Y——山皂荚多糖的得率，%；

m——提取纯化后山皂荚多糖的质量，g；

M——山皂荚干粉质量，g。

1.2.2 单因素试验 以山皂荚多糖得率为考核指标，选取可能影响多糖得率的液固比、提取时间、提取温度进行单因素试验，确定每个因素对山皂荚多糖得率的影响范围。

(1) 液固比的影响：固定提取温度60 ℃，回流时间80 min，回流2次，分别设置液固比为25∶1，35∶1，45∶1，55∶1，65∶1，75∶1，85∶1，95∶1(mL/g)，考察液固比对山皂荚多糖得率的影响。

(2) 提取时间的影响：固定提取温度60 ℃，液固比55∶1(mL/g)，分别回流提取30，50，70，90，110，130，150，170 min，回流2次，考察提取时间对山皂荚多糖得率的影响。

(3) 提取温度的影响：固定液固比55∶1(mL/g)，回流提取2次，每次80 min，分别设置温度为20，30，40，50，60，70，80，90 ℃，考察提取温度对山皂荚多糖得率的影响。

1.2.3 响应曲面法优化提取工艺 综合单因素试验中各个单因素的试验结果，将液固比、提取时间及提取温度3个因素作为本次响应面法的主要考察因素，以山皂荚多糖得率为考察指标，根据试验结果进行数据分析，模型确立，从而确定最优提取工艺条件。

1.2.4 抑菌试验

(1) 供试溶液制备：将1.2.1提取所得的山皂荚精多糖用无菌水分别配置成25，50，75，100 mg/mL的多糖溶液，滤膜过滤，备用。

(2) 菌悬液的的制备：将试验菌接入斜面培养基中进行活化(置于37 ℃恒温箱中，培养24 h)，然后制备菌悬液(挑取活化菌种于生理盐水中)，菌悬液浓度约为106～107CFU/mL。

(3) 抑菌效果测定：采用滤纸片扩散法[16-18]，将细菌培养基倒入培养皿中，待凝固后，吸取0.2 mL菌悬液于培养皿内，涂抹均匀，用镊子取出经不同浓度皂荚多糖溶液浸泡过的滤纸片(6 mm滤纸圆片，经160 ℃干热灭菌2 h)，每个平皿放3个滤纸片，用无菌水浸泡的滤纸片做对照，每种菌重复做3次，每个浓度平行做5个。倒置于水循环式恒温培养箱中37 ℃，培养24 h后，测量抑菌圈的直径。

1.2.5 数据处理方法 采用Design-Expert 8.0.6对山皂荚多糖提取结果进行处理，对试验数据进行回归分析，对模型进行显著性分析，从而得出最优提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 山皂荚多糖提取单因素试验

2.1.1 液固比的影响 由图1可知，山皂荚多糖的得率会随着液固比的增大而有明显的升高趋势，当液固比为55∶1(mL/g)时皂荚多糖得率最大，而当液固比再持续增大后，皂荚多糖得率未见增加，而呈现出下降趋势。这是由于液固比的大小决定固液两相的混合情况，从而改变传质速率。当液固比较小时，固相浓度较低，不利于整体得率的提高，当液固比较高时，会出现搅拌不均匀，固液两相混合不彻底的现象，且醇沉不彻底，从而使得率降低，因此，适宜固液比为55∶1(mL/g)。

2.1.2 提取时间的影响 由图2可知，山皂荚多糖得率在提取初始随着提取时间的增加而明显提高，提取时间的延长有助于多糖的充分浸提，当提取时间为80～90 min时，多糖得率最大，继续延长提取时间后，由于多糖结构部分发生了破坏和降解，使山皂荚多糖得率不再增加，并且呈现下降趋势，综合考虑山皂荚多糖得率和节能，适宜提取时间为80 min。

Figure 1 Effect of liquid/material rate on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

2.1.3 提取温度的影响 由图3可知，在反应初始阶段，皂荚多糖得率会随着提取温度的升高而有明显的增大，说明温度较高有助于破坏细胞结构，使多糖能够较好地浸出；当温度为60 ℃时，皂荚多糖得率达到最大，之后开始下降，温度过高可使皂荚多糖糖链发生断裂，生物活性受损，得率下降，因此，适宜提取温度为60 ℃。

Figure 2 Effect of extraction time on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

Figure 3 Effect of the extraction temperature on yield of polysaccharide inGleditsiajaponic.miq

2.2 响应曲面法优化皂荚多糖提取工艺试验结果

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken设计法制定试验方案，对影响多糖得率的液固比、提取时间、提取温度3个因素进行因素水平设计，得到17个试验点的设计方案，试验设计与结果见表1、2。

使用Design-Expert 8.0.6软件进行试验结果分析，以山皂荚多糖得率为响应值，得到多元回归方程为：

Y=31.40+0.76A-0.43B+0.48C-7.85A2-1.23B2-1.81C2+0.06AB+0.17AC+0.42BC(R2=0.999 6)。

(2)

2.3 皂荚多糖提取工艺的响应曲面法分析

由图4可知，液固比对响应值的影响较提取时间图形陡，液固比的曲线呈现先升高后降低的趋势，且变化幅度较

表3 回归方程方差分析†

Table 3 Result of variance (ANOVA) analysis for the fitted quadratic polynomial model

† **表示极显著(P<0.01)，*表示显著(P<0.05)。

大；提取时间的曲线较平缓，表明其对多糖得率的影响较小，且交互作用不显著。由图5可知，液固比对响应值的影响较提取温度图形陡，曲线先升高后降低，变化幅度较大，提取温度图形走向较为平缓，表明其对多糖得率变化的影响不大。由图6可知，提取温度和提取时间的曲线均较平缓，表明其对多糖得率的影响较不明显。

本试验根据响应曲面设计所得山皂荚多糖的最优提取工艺条件为：液固比51.02∶1(mL/g)，提取温度64.77 ℃，提取时间82.02 min，在该提取工艺条件下得率最大可达31.502 5%。考虑到在实际操作条件，会有一定的限制，所以将以上结果优化为：液固比50∶1(mL/g)，提取时间80 min，提取温度65 ℃，在此提取条件下平行实验3次，测得皂荚多糖得率为(31.52±0.54)%，与预测值基本一致，说明本次响应面法所得到的山皂荚多糖提取工艺参数准确可用。

2.4 山皂荚多糖抑菌活性

由表4可知，当皂荚多糖浓度为100 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制效果最好，抑菌圈分别为14.5，12.0 mm；该浓度下多糖对沙门氏菌、大肠杆菌与蜡样芽胞杆菌也具有一定的抑制作用，抑菌圈均在7 mm以上。同时可看出，随着多糖浓度的增加，抑菌圈直径呈增大趋势。

当皂荚多糖溶液浓度为100 mg/mL时，多糖溶液对细菌的抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>蜡样芽孢杆菌>大肠杆菌>沙门氏菌。整体而言，山皂荚多糖对革兰氏阳性菌的抑菌作用较革兰氏阴性菌强。

由表5可知，山皂荚多糖对供试菌有不同程度的抑制作用，其抑菌活性随着多糖浓度的降低而逐渐减弱，当多糖浓度在15 mg/mL时，对5种供试菌均无抑菌活性，当多糖浓度在50 mg/mL及以上时，抑菌作用较为显著。山皂荚多糖的最小抑菌浓度MIC分别为：金黄色葡萄球菌25 mg/mL，大肠杆菌50 mg/mL，沙门氏菌50 mg/mL，枯草芽孢杆菌25 mg/mL，蜡样芽胞杆菌50 mg/mL。

3 结论

采用应用响应曲面分析法对山皂荚多糖的水提取工艺进行优化，得到较为理想的多糖提取条件：液固比为50∶1(mL/g)，提取时间为80 min，提取温度为65 ℃，在此提取条件下山皂荚多糖的得率为(31.52±0.54)%，相较于其他提取方法，水提法是一种较为方便经济的方法；抑菌试验表明山皂荚多糖具有一定的抑制金黄色葡萄糖菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌生长的作用，但影响山皂荚多糖抑菌效果的因素较多，本试验只选用了一种品系的皂荚多糖和一种提取方法，下一步可对不同品系和不同提取方法的皂荚多糖抑菌效果展开系统全面的研究。

† “+” 表示有抑菌圈，“-”表示无抑菌圈。

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Extraction of polysaccharide fromGleditsiajaponic.miqand its antibacterial activities

GAO Jie1DONGWen-bin2,3WANGYong4WANGYan1

(1.CollegeofMedical,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang,Shaanxi712046,China; 2.ShaanxiUniversityofScience&Technology,Xi‘an,Shaanxi710000,China; 3.ShaanxiResearchInstituteofFoodProcessingTechnology,Xi‘an,Shaanxi710000,China; 4.ShaanxiResearchInstituteofAgriculturalProductsProcessingTechnology,Xi‘an,Shaanxi71000,China)

The polysaccharide inGleditsiajaponic.miqwas researched. Based on the single factor level determination, the major factors including liquid/material ratio, extraction temperature and time were investigated by response surface analysis, and then its antibacterial activity was studied by filter paper diffusion method. The results showed that the optimum technology condition were using liquid/material at 50 mL/g, extracted at 65 ℃ for 80 min. Under these conditions, the yield of polysaccharide was (31.52±0.54) %. Furthermore, when the concentration of polysaccharide was 100 mg/mL, the antibacterial activity was in this order,S.typhimurium

Gleditsiajaponic.miq; polysaccharide; antibacterial activities

陕西省教育厅科研计划项目(编号：12JK1044)；陕西省咸阳市科技局科学技术研究项目(编号：2015K04-20)

高洁，女，陕西国际商贸学院讲师，硕士。

董文宾(1951—)，男，陕西科技大学教授，博士生导师，硕士。E-mail：251536749@qq.com

2016—12—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.030