米糠固态发酵工艺优化及其氨基酸变化

尹孝超 钱海峰 王 立 张 晖 齐希光

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

米糠固态发酵工艺优化及其氨基酸变化

尹孝超 钱海峰 王 立 张 晖 齐希光

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

对米糠进行固态发酵，研究其蛋白、脂肪、灰分和总糖含量的变化规律，以期找到一种有效深度开发米糠资源的方法。结果表明：蛋白和灰分含量相比于发酵前明显增加，脂肪和总糖含量随着发酵时间的延长逐渐降低。以真蛋白含量为响应值，对固态发酵条件进行响应面辅助优化，确定最佳发酵条件为温度37 ℃，时间102 h，水分含量60%，初始pH 5.5，接种量20 mL/100 g，发酵米糠的真蛋白含量19.65%，比原米糠提高了41.88%。此外，对米糠的氨基酸组成进行分析，蛋氨酸和苏氨酸占总氨基酸含量分别提高了73.92%和22.99%。

固态发酵；米糠；黑曲霉

米糠是稻谷在加工过程中产生的副产品，是由糙米经碾米获得的，包含种皮、果皮、胚乳和糊粉层等。中国年产稻米超过2.0×108t，米糠产量在1.2×107t左右，因此米糠资源非常丰富[1]。米糠中含有丰富的营养物质，蛋白含量12%～16%，脂肪16%～22%，纤维含量8%～12%[2]，以及维生素、多糖等生理活性物质。其中米糠蛋白的营养价值可与动物蛋白相媲美，可溶性蛋白约占总米糠的70%，具有低过敏性，其氨基酸组成与FAO/WHO的推荐模式相接近[3-6]。米糠蛋白虽然营养价值高，但是天然米糠中的蛋白质与纤维素、半纤维素、植酸钙等物质结合紧密，不易被利用[7]。而且米糠蛋白的提取和分离纯化难度大，限制了米糠蛋白的工业化生产和应用[8]。在中国，米糠利用还停留在初级阶段，被直接作为畜禽饲料，消化利用率低，导致米糠资源未能得到深度开发。近年来，随着对米糠资源的开发，米糠油、米糠多肽、米糠多糖等产品陆续出现，米糠资源的开发利用越来越受到研究者的重视。

固态发酵产品的优点突出，例如：① 将植物蛋白转变成优质的菌体蛋白[9]；② 生产效率高，不受自然条件限制[10]；③ 能够调节动物肠道菌群结构，有助于改善消化系统[11]；④ 包含多种酶系，有利于消化吸收[12]；⑤ 设备简单，投资少等[13]。黑曲霉菌株产生的酶系丰富且酶活高，如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，且生长速度快，是公认的无毒无害菌株[14]。目前，国内外对于固态发酵米糠的研究主要集中在静态发酵米糠提取生理活性物质方面，对于发酵米糠中蛋白质的富集优化鲜有报道。试验中的翻料可以起到降低物料温度的作用，同时黑曲霉是好氧真菌，翻料可以促进体系中气体的交换，更加有利于发酵的进行。

本试验采用黑曲霉菌株固态发酵米糠，研究米糠成分在固态发酵过程的变化，并对发酵米糠中的蛋白富集进行响应面优化试验，旨在制得一种高蛋白发酵米糠产品，以及为今后米糠在固态发酵方面的深度开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉(AspergillusnigerF0045)：江南大学微生物菌种保藏中心；

察氏培养基(活化培养基)：蔗糖 30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 000 mL，调pH至 7.2；

稳定化未脱脂米糠：真蛋白含量13.85%，脂肪含量16.71%，灰分含量7.01%，总糖含量342.33 mg/g，益海嘉里粮油食品有限公司，过40目筛，贮藏于-20 ℃冰箱中；

试验所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

消解仪：HYP-1008型，济南海能仪器股份有限公司；

全自动凯氏定氮仪：K9860型，济南海能仪器股份有限公司；

霉菌培养箱：BMJ-160型，上海博迅实业有限公司；

超净工作台：SW-CJ-1FD型，苏州安泰空气净化技术有限公司；

氨基酸专用高效液相色谱仪：Agilent1260型，日本岛津公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-50 SII型，上海博迅实业有限公司；

分析天平：BSA224S型，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；

鼓风干燥箱：DHG-9055A型，上海一恒科学仪器有限公司；

pH计：STARTER3100/F型，梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵米糠菌种的制备 取保存的黑曲霉斜面菌种一环，接种到试管斜面培养基上，于28 ℃下培养6 d，待斜面长满黑色孢子后，用无菌蒸馏水洗涤斜面，用接种环轻轻刮下孢子，收集孢子悬液，用无菌纱布过滤。用血球计数板计数，至少计数3次，取相近的3个值的平均值作为孢子浓度。调整孢子悬液浓度在4.0×105mL-1。

1.3.2 发酵米糠的方法 称取稳定化米糠10 g于250 mL三角瓶中，加入蒸馏水调整基质水分含量至60%，瓶口用八层纱布覆盖。放入灭菌罐121 ℃，20 min。灭菌完后取出，冷却。加入5 mL已灭菌的营养液(KH2PO42 g/L，MgSO41.5 g/L，NH2CONH25 g/L溶于0.4 mol/L的HCl中[15])和2 mL孢子悬液，搅拌均匀。放置于34 ℃霉菌培养箱中，保持湿度90%，每隔24 h翻料和补水3 mL一次。发酵72 h后，置于60 ℃烘箱烘干至恒重，保存待测。

1.3.3 发酵米糠的成分测定方法 发酵米糠中的真蛋白含量测定参照胡艳丽[16]方法进行，用凯氏定氮法测定真蛋白含量(蛋白转换系数设为6.25)。脂肪、灰分和总糖含量的测定分别按GB/T 14772—2008、GB 5009.4—2016和GB/T 15672—2009执行。

水解氨基酸含量测定：称量100.0 mg样品放入50 mL水解管中，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，充氮气封管，放入120 ℃烘箱中水解22 h，水解完全后冷却，加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和并用蒸馏水定容至25 mL，双层滤纸过滤后，取1 mL滤液10 000 r/min离心10 min，取上清液400 μL上机进样。

1.3.4 固态发酵对米糠成分的影响 研究固态发酵对米糠中蛋白、脂肪、灰分和总糖含量的影响。选择在温度34 ℃、接种量20 mL/100 g米糠、初始pH 5.5和初始水分含量60%的条件下进行米糠固态发酵，发酵结束后，将样品放入60 ℃烘箱烘干至恒重，保存待测。测定方法见1.3.3。

1.3.5 发酵条件的单因素试验设计

(1) 发酵温度：在接种量1 mL，发酵时间96 h，装料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的条件下，考察发酵温度(28，31，34，37，40 ℃)对发酵米糠真蛋白含量的影响。

(2) 接种量：在发酵温度28 ℃，发酵时间96 h，装料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的条件下，考察接种量(1，2，3，4，5 mL)对发酵米糠真蛋白含量的影响。

(3) 发酵时间：在发酵温度28 ℃，接种量1 mL，装料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的条件下，考察发酵时间(48，72，96，120，144 h)对发酵米糠真蛋白含量的影响。

(4) 装料量：在发酵温度28 ℃，接种量1 mL，发酵时间96 h，初始pH 5.5，初始水分含量50%的条件下，考察装料量(10，15，20 g)对发酵米糠真蛋白含量的影响。

(5) 初始pH：在发酵温度28 ℃，接种量1 mL，发酵时间96 h，装料量10 g，初始水分含量50%的条件下，考察初始pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0)对发酵米糠真蛋白含量的影响。

(6) 初始水分含量：在发酵温度28 ℃，接种量1 mL，发酵时间96 h，装料量10 g，初始pH 5.5的条件下，考察初始水分含量 (40，50，60，70，80%)对发酵米糠真蛋白含量的影响。

1.3.6 Plackett-Burman试验设计 在单因素结果分析的基础上，利用Design-Expert.8.0.5软件，设计Plackett-Burman(PB)试验，以初始pH、装料量、初始水分含量、时间、温度和接种量为影响因素，设置高低两个水平，高水平为低水平的1.25倍。以发酵米糠中真蛋白含量为响应值，根据各因素的显著性，筛选出最主要的因素进行固态发酵条件的响应面优化试验。

1.3.7 响应面试验设计 由PB试验优化得到的3个最显著的因素(温度、时间、初始水分含量)设计响应面试验，利用Design-Expert.8.0.5软件进行Box-Behnken中心组合试验设计。得到二次回归方程，确定最佳固态发酵条件组合。

1.3.8 验证实验和数据分析 根据二次回归方程得出的最佳发酵条件组合，设计验证实验。以上试验均做3组平行。PB试验和Box-Behnken中心组合试验数据分析及处理由Design-Expert.8.0.5软件和SPASS软件辅助完成。

2 结果与分析

2.1 固态发酵对米糠成分的影响

2.1.1 固态发酵对米糠中真蛋白含量的影响 由图1可知，真蛋白含量在发酵72 h时达到最大值，之后随着发酵时间的延长逐渐降低。发酵过程中真蛋白含量的增加主要由外加氮源的加入和蛋白质“浓缩效应”[17]共同完成。外加氮源的加入使得黑曲霉利用无机氮源合成自身的菌体蛋白，提高了发酵米糠的真蛋白含量。与此同时，在发酵过程中黑曲霉的生长呼吸作用，产生了二氧化碳和水，使得发酵产物的质量减少，出现了蛋白质的“浓缩效应”。

发酵前期，菌体生长代谢活动较旺盛，利用基质中无机氮源和有机氮源进行自身菌体蛋白的合成，蛋白含量增加。此时基质中菌体的蛋白合成能力大于蛋白分解能力。发酵后期，菌体进入衰亡期，此时菌体的蛋白分解能力大于蛋白合成能力，所以蛋白含量会有所下降，此时蛋白含量的下降可能是真菌对蛋白分解作用和基质“浓缩作用”共同完成。Silveira等[18]利用根霉固态发酵脱脂米糠，粗蛋白含量提高了69%。Schmidt等[15]利用米根霉半固态发酵米糠，粗蛋白含量较未发酵米糠提高了53%。总之，固态发酵对真蛋白含量有积极的影响。

2.1.2 固态发酵对米糠中脂肪和灰分含量的影响 由图2可知，米糠未发酵之前的脂肪含量为16.91%，脂肪含量随着发酵时间的延长逐渐降低，经过96 h的固态发酵之后，脂肪含量降到11.48%，固态发酵过程中脂肪含量的降低可能是由于脂肪被真菌利用，用来合成自身的生物膜系统中的磷脂[19]。Larine等[20]利用米根霉固态发酵米糠120 h，脂肪含量从15.2%降至7.4%，降低了51.32%，差异显著(P<0.05)。固态发酵可以降低米糠中的脂肪含量，而米糠的酸败问题主要是脂肪酶分解脂肪造成的。所以，固态发酵可以作为一种潜在的米糠保存方式。

由图2还可知，灰分含量随发酵时间的延长逐渐增加。发酵120 h后测定发酵米糠中灰分含量，其含量从原来的7.01%增加到8.91%，增加了27.10%。主要是由于黑曲霉利用米糠中的营养物质进行生长代谢，真菌生物量增加，米糠中大分子物质被菌体利用分解，基质中小分子物质增加，无机物增多。Larine等[20]利用米根霉固态发酵米糠120 h时，灰分含量从9.4%增加到13.9%，增加了47.87%，表现出显著性差异(P<0.05)。与本研究结果趋势一致。

2.1.3 固态发酵对米糠中总糖含量的影响 由图3可知，发酵过程中总糖含量持续下降，发酵96 h后，米糠中的总糖含量从342.33 mg/g降至221.67 mg/g，降低了35.25%，差异显著(P<0.05)。表明基质中的糖类被菌体利用，分解产生能量和小分子物质供菌体进行生长代谢活动。发酵初期，菌体生长较快，在菌体生长过程中产生的纤维素酶、淀粉酶等对多糖的降解作用，导致总糖含量下降较快。发酵后期基质已不再适合菌体生长，菌体分解利用糖类变慢，总糖含量下降速度减缓。

2.2 响应面优化试验结果与分析

2.2.1 Plackett-Burman试验设计及结果分析 以真蛋白含量为响应值，设计米糠固态发酵条件的响应面优化试验。由单因素试验结果分析得出Plackett-Burman(PB)试验设计方案见表1，对初始pH、装料量、初始水分含量、时间、温度和接种量进行显著性分析，设置高水平为低水平的1.25倍。利用Design-Expert.8.0.5软件辅助分析PB试验结果。由表2可知，6个因素对固态发酵米糠中真蛋白含量的影响顺序为：温度>时间>初始水分含量>装料量=接种量>初始pH。根据ANOVA分析，得出该模型显著(P=0.003 6<0.05)，R2=0.952 6，说明该模型有95.26%的数据可信。

2.2.2 响应面设计试验结果及分析 由PB试验得出的影响固态发酵米糠中真蛋白含量的3个显著性因素，利用Design-Expert.8.0.5软件进行Box-Behnken的中心组合试验设计，以温度、时间和初始水分含量为因素，设计三因素三水平的试验方案，设计方案见表3、4。试验结果分析由Design-Expert.8.0.5软件辅助完成。

根据响应面ANOVA结果分析得到因素A、B、C的二次回归方程：

Y=19.7-0.14A+0.69B-0.53C+0.29AB-0.82AC+0.7BC-0.53A2-1.05B2-1.3C2。

(1)

由表5可知，P=0.000 9<0.01，表明模型以真蛋白含量为响应值时，该模型极显著。失拟项P=0.191 4>0.1，表明试验结果和模型方程拟合良好。相关系数R2=0.949 4，表明有94.94%的数据可以由模型方程解释。CV越小，说明模型置信度越好。该模型变异系数CV=2.4%，说明模型方程能够较好地反映真实的试验值。校正决定系数为0.884 4，说明该模型可以解释88.44%的数据变异。综上所述，该模型为固态发酵条件提供了一个很好的选择。

† 同一列数据不同字母表示差异显著(P<0.05)。

†R2=0.952 6。

由回归方程得到的固态发酵最佳条件：温度37.18 ℃，时间102.86 h，初始水分含量58.52%，得到真蛋白含量为19.83%，比原米糠蛋白含量提高了43.17%。验证实验选择条件发酵时间37 ℃，时间102 h，初始水分含量60%，接种量20 mL/100 g米糠，初始pH 5.5，装料量150 g，固态发酵在托盘中进行，得到发酵米糠的真蛋白含量为19.65%。比原米糠蛋白含量提高了41.88%。试验结果与预测试验结果相差不大，说明固态发酵优化工艺有效。

† 同一列数据不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 发酵米糠中17种常规水解氨基酸含量的变化

考虑到发酵米糠的适口性、外观性以及发酵成本等因素，根据实际情况选择缩短发酵时间，降低发酵温度来抑制孢子的形成并降低能耗，最终选择发酵温度34 ℃，发酵时间72 h，初始水分含量60%，初始pH 5.5，接种量20 mL/100 g米糠，得到的真蛋白含量为18.15%，较原米糠提高了31.05%。此条件下发酵米糠中黑曲霉孢子得到很好的抑制，发酵成本降低，品质达到很好的改善。在此条件下测定氨基酸含量的变化。

†R2=0.949 4，AdjR2=0.884 4，CV=2.40%，Adeq Precision=12.647。

由表6可知，发酵过程中氨基酸含量在不断增加，原米糠中氨基酸含量为11.76%，发酵72 h后氨基酸总量达到15.22%，较原米糠增加了29.42%，差异显著(P<0.05)。蛋白质的营养价值取决于氨基酸种类和含量，其中必需氨基酸的含量是评价蛋白质质量的一个重要指标。发酵72 h时，限制性氨基酸蛋氨酸、苏氨酸占总氨基酸含量显著增加(P<0.05)，分别增加了73.92%和22.99%。发酵96 h时，总氨基酸含量略有下降，主要是基质中大部分营养物质被利用，此时发酵体系中菌体对蛋白的分解能力大于蛋白合成能力。总的来说，固态发酵能够有效改善氨基酸组成，使必需氨基酸和限制性氨基酸较发酵前都有所提高。因此，固态发酵对米糠中的氨基酸组成起到了很好的改善作用。

3 结论

(1) 固态发酵对米糠成分的改善有一定作用。在一定的发酵时间内，蛋白和灰分含量随着发酵时间的延长逐渐增加，脂肪和总糖含量则逐渐降低。这为今后米糠在固态发酵方面的应用和发展提供了一定的理论基础。

† 同一行数据不同字母表示差异显著(P<0.05)。

(2) 固态发酵过程中真蛋白的富集优化试验表明，最佳发酵条件为：温度37 ℃，时间102 h，初始水分含量60%，初始pH 5.5，接种量20 mL/100 g米糠，此时发酵米糠的真蛋白含量19.65%，比原米糠提高了41.88%。因此，固态发酵米糠可以作为一种生产高蛋白发酵产品的潜在方式。

(3) 固态发酵过程中富集真蛋白的来源和性质还需进一步进行研究和分析。

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Effect of solid-state fermentation on the ingredients of rice bran

YIN Xiao-chaoQIANHai-fengWANGLiZHANGHuiQIXi-guang

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

In this paper, the changes of protein, lipid, ash and total sugar of rice bran after solid-state fermentation were studied for deep development of rice bran resources. The results showed that the contents of protein and ash increased significantly after fermentation. Moreover, the contents of lipid and total sugar decreased gradually with fermentation time. The optimized fermentation condition was: 37 ℃, 102 h, moisture content of 60%, initial pH 5.5, inoculation amount of 20 mL/100 g, with the true protein content as the response value. In this condition，the true protein content of fermented rice bran was 19.65%,increased 41.88% compared with the raw rice bran. In addition, the results of amino acid analysis showed that the contents of methionine and threonine were increased by 73.92% and 22.99% respectively compared with the original rice bran.

Solid-state fermentation; Rice bran;Aspergillusniger

十二五863计划(编号：2013AA102203-07)

尹孝超，男，江南大学在读硕士研究生。

钱海峰(1973—)，男，江南大学副教授，博士。 E-mail: qianhaifeng@jiangnan.edu.cn

2017-01-04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.009