压力—温度协同作用下华根霉脂肪酶的催化行为研究

陈 刚 缪 铭 江 波 冯 骉,

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

压力—温度协同作用下华根霉脂肪酶的催化行为研究

陈 刚1缪 铭2江 波2冯 骉1,2

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122)

研究了高压处理中压力和温度对华根霉脂肪酶的活力和稳定性的影响，并利用活性酶↔变性酶的双态模型考察了酶的热变性，并构建压力—温度二元相图。研究结果表明：在0.1～200.0 MPa时，华根霉脂肪酶活力随压力提升而增加，其中在压力200 MPa时酶活达到最高值，是常压下初始酶活的116%；当压力超过200 MPa时，酶活开始降低，尤其在400～600 MPa范围内迅速降低。压力—温度协同作用下华根霉脂肪酶的加工稳定性数据显示，在200 MPa、40 ℃下酶热稳定性最佳，压力超350 MPa时酶热稳定性显著降低。

高压；脂肪酶；温度；酶活；热稳定性；催化行为；双态模型

高静压(高压)技术是一种非热加工技术，有利于很好地保持和改善食品的功能和品质[1]。高压技术的一项典型应用是灭菌[2]，20世纪90年代国外就有高压处理果汁、肉制品等产品面市。高压处理也能够钝化食品内源酶，这一特性已被尝试应用于食品加工和保藏中。超高压灭菌的效果受环境因素如温度、pH、离子强度等的影响，有关此方面的研究已有相当积累[3]。环境因子的影响也体现在高压处理对酶活性和稳定性的影响[4]，特别是温度对酶的催化活性具有重要作用。

高压环境对酶的活力能产生重要的影响[4-5]，这一现象可用于诱导调节酶活，脂肪酶可作为典型实例来研究[6]。脂肪酶属于丝氨酸水解酶类，能够打断酯键而水解酯类，在微水的有机环境中则能催化醇、酸合成酯的反应，近年来非水相合成成为了酶工程的热点[7]。研究[8-9]发现某些脂肪酶经高压处理后活力有所提高，而有些脂肪酶则不存在此现象。本研究拟以华根霉脂肪酶(R.chinensislipase，RCL)为研究对象，考察其在压力—温度协同处理下的催化特性和稳定性变化，以期为调控与食品相关的酶类的催化行为提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

华根霉脂肪酶：1 100 U/mg，泰兴一鸣公司；

酚酞、95%乙醇、聚乙烯醇、氢氧化钠、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

橄榄油：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

超高压实验设备：MICRO FOODLAB FPG5740型，英国Standerd Fluid Power公司；

循环水浴系统：HAAKE SC 100型，美国Thermo Scientific公司；

电热恒温水槽：DK-8D型，上海森信实验仪器有限公司；

pH计：Delta 320s型，梅特勒-托利多仪器有限公司；

磁力搅拌器：HS7型，德国 IKA 公司；

精密天平：XS204型，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力的测定 底物溶液的配制：将40 g聚乙烯醇加入1 L去离子水中高温搅拌溶解至无颗粒，待冷却后用3层纱布过滤，得到4%聚乙烯醇溶液。将聚乙烯醇溶液和橄榄油以3∶1的体积比混合均质10 min，备用。

脂肪酶活力具体测定方法参见橄榄油乳化法[8]。除特别指出外，反应体系所用的缓冲溶液均为pH 7.5 的磷酸缓冲液；相对残余酶活定义为测得的酶活与40 ℃、0.1 MPa下的酶活之比。

1.2.2 酶液的高压处理 在高压设备上设定压力和加压时间，以体积分数30% 1,2-丙二醇为传压介质，并通过循环水浴稳定试验温度。将盛有酶液的耐高压密封管放入高压腔内处理，高压处理完毕后立即取出并测定酶活。

1.2.3 高压处理对RCL活力的影响 将16 mg粗酶粉溶于500 mL pH 7.5的缓冲液，配制为适当浓度的酶液。将该酶液装入耐高压密封管中，分别在40 ℃下以100，150，200，300，400，500，600 MPa处理10 min,泄压后立刻取出并测其相对酶活。

1.2.4 温度对RCL活力的影响 将上述酶液分别在0.1 MPa 和200 MPa下以35，40，45，50，60，70 ℃温度处理10 min。取出后立刻分别在40 ℃和相应温度下测定酶活。在相应处理温度下测定的酶活表示酶在给定压力下处理后的活力与处理温度间的关系，在40 ℃下测定的酶活表示酶经处理后的残余活力。

1.2.5 压力和温度对RCL热稳定性的影响 将上法配制的酶液(缓冲液改为Tris-HCl，pH 7.5)分别在不同温度(40，50，55，60 ℃)下以0.1，200.0，350.0，400.0，450.0，500.0 MPa的压力处理不同时间，泄压后立刻取出并测其活力。

1.2.6 温度—压力协同作用下RCL的热失活动力学 将上法配制的酶液(缓冲液改为Tris-HCl，pH 7.5)分别在10，15，20，25，30，35，40 ℃下以50，100，150，200，250，300 MPa处理10 min。40 ℃保温3 min的6个样品(4 mL底物溶液和5 mL浓度0.025 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl溶液混合制成)中依序加入0.9 mL处理后的脂肪酶酶溶液，计时。在反应2，3，4，5，6，7 min时分别加入15 mL 95%乙醇灭活，以50 mmol/L 的NaOH溶液滴定并记录数据，以NaOH耗用量对时间作图，用线性回归法得到反应速率。

图中所有数据均为多次重复试验后的均值。

2 结果与分析

2.1 高压处理后RCL活力的变化

图1表示RCL的水解酶活在40 ℃、pH 7.5下随压力的变化情况。由图1可知，该脂肪酶经0.1～200.0 MPa 处理后，其水解活力随着压力的提高而提高，在200 MPa 达到最大值，为常压下原酶活力的116%，该压力可当作此条件下该酶反应的最适压力。当压力高于200 MPa以后，RCL酶活开始下降，但直到压力为350 MPa时仍高于常压下的酶活。此后，随着压力的提高，酶活开始下降到100%以下；在400～600 MPa范围内酶活显著降低，说明此高压下RCL快速失活。

大多数酶在高压作用下易失活，Noel等[9]研究发现米黑毛霉脂肪酶在经过高压处理后处于钝化状态。也有部分报道表明在合适的高压处理后某些酶的酶活会得到提升，杨新颖等[8]发现在低于400 MPa的压力作用下解脂耶氏酵母脂肪酶的活力会得到提高，而压力超过500 MPa时则急剧下降。杜焕梅等[4]的研究结果与本研究相似，该研究发现在0.1～200.0 MPa时，皱褶假丝酵母脂肪酶的酶活随压力的提高而逐渐提高，当压力超过200 MPa时开始下降，表明只有在合适的压力范围内才能提高酶的催化能力。李赟高等[3]报道在200 MPa时菊糖果糖转移酶酶活提高了30%左右，并在600 MPa时明显失活。赵伟等[1]发现在小于200 MPa的压力作用下，牡蛎中的蛋白酶水解蛋白的活力显著提高。Chen等[7]报道，米根霉脂肪酶与假丝酵母脂肪酶的酶活都随着α-螺旋比例的提高而逐渐提升。刘苗等[10]发现高压下菊糖果糖转移酶酶活的变化与高压诱导内源荧光变化存在相关性。这些现象说明经高压处理后，酶结构的变化与酶活的变化有一定的关系。

2.2 在不同温度下经高压处理后的RCL活力的变化

固定压力为200 MPa，在不同温度下处理RCL并测定其活力，得到经给定压力处理后酶的活力与处理温度间的关系，见图2。由图2可知，200 MPa下脂肪酶RCL的相对酶活相对于常压下的都有提高，两条曲线几乎是并行的。在两种压力下，该酶的最佳催化温度均位于40～45 ℃，表明高压对该酶的最佳催化温度几乎没有影响。这与某些报道所观察到的现象有所不同，杨新颖等[8]发现高压处理后解脂耶氏假丝酵母脂肪酶的最适反应温度偏移了5 ℃左右。在催化过程中，温度不仅可提供酶催化反应所需要的能量，促使酶的催化能力提高或者降低；此外，压力能够改变酶的构象，因此不同压力处理可能会使酶的最适催化温度发生迁移。

经200 MPa和不同温度处理后测定RCL在40 ℃下的活力，可得到RCL在处理后的残余活力，同时也比较了常压下的酶活力，见图3。由图3可知，在35～50 ℃时，不同温度下200 MPa的压力作用导致的RCL活力提升略有不同，造成了RCL的残余活力轻微波动。随着温度继续升高，由50 ℃到70 ℃时，RCL活力明显下降，但下降速度慢于常压下的速度。在处理温度低于55 ℃时，该酶的残余活力都高于初始酶活，表明200 MPa的压力对该酶有保护作用。当温度达到70 ℃时，残余酶活仍有58%。而在0.1 MPa下该酶的活力随温度的提高快速下降，至70 ℃时已经完全失活。上述结果表明，最适压力下不仅酶的催化性能得到提高，而且酶抵抗热变性的能力也提高了。其它学者[3,10]也得到了相似研究结果，在200 MPa、60 ℃处理条件下，菊糖果糖转移酶的残余活力明显提高。

2.3 压力和温度对RCL热稳定性的协同作用

从上述研究可知，合适的高压处理既能提高华根霉脂肪酶活力又有助于提高其耐热性，而过高压力则会引起脂肪酶的钝化。研究[3]发现离子强度会影响酶的活力和稳定性。为排除盐离子的影响，试验选取Tris-HCl (pH 7.5)作为缓冲液。

在200，500 MPa下温度对脂肪酶热稳定性的影响见图4。总体而言，两种压力下热稳定性皆随温度的提升逐渐降低。图4(a)表明，在200 MPa、40 ℃下保压1 h后，脂肪酶残余活力仍保持在原酶的100%左右，热稳定性很好。在温度提升到50 ℃时，其热稳定性略有降低。当提升到55 ℃以上，残余酶活则显著降低，热稳定性明显变差。这表明即使在最适压力下，脂肪酶在较高温度下的热失活作用仍不可避免。尽管在50 ℃时200 MPa的压力可以明显改善酶的催化能力并提高酶的稳定性，但当温度提升到60 ℃时酶的失活速率明显增加。图4(b)显示了500 MPa下RCL的热稳定性，酶活在最佳催化温度下仍急剧下降，表明该酶热稳定性变差。有报道[6,11]指出，表面压力诱导的酶钝化伴随着酶蛋白中更多的疏水区域暴露于水溶液中，在一定程度上会促进热失活。因此500 MPa的压力处理将使酶热稳性变差。

结果显示，在压力200 MPa、温度40～55 ℃时，RCL活力与处理时间呈线性关系；而当温度超过55 ℃时则呈曲线关系，这种现象也在其他脂肪酶的高压热稳定性行为中被观察到。Noel等[9]报道经过同样的高压处理，40～50 ℃时米黑毛霉脂肪酶的残余活力与处理时间呈线性关系，而在55～60 ℃时呈非线性关系，研究发现压力的介入使得热失活发生改变。通常认为酶的热失活速率服从一阶微分方程，在半对数坐标中活力与时间为线性关系。但高压下RCL的热失活速率显然不服从一阶微分方程，表明高压下热失活的动力学发生了改变。从图4(b)可知，酶活与处理时间呈非线性关系，说明压力较高时，压力会加快该酶的失活，这与本研究观察到在500 MPa下RCL折叠展开而失活的现象相一致。

50 ℃下压力对RCL热稳定性的影响见图5 (a)。由图5可知，只有200 MPa的处理才能显著改善RCL的热稳定性；而在350 MPa下处理时，尽管酶的催化活性并不低于0.1 MPa下的，但热稳定性依然变差，并且随着压力的提高变得越来越差。

图5与图4(a)中的曲线有相似之处，当压力升高到一定程度后，RCL活力与时间的关系开始由直线转变为曲线，说明酶的热失活动力学改变了，这对于超高压加工技术在食品杀菌与钝化酶中的应用有重要启示。60 ℃下压力对RCL热稳定性的影响与图5(a)趋势相同，只是在相同压力下酶的失活速率加快，在350 MPa下RCL活力与时间的关系已经呈曲线关系。而压力超过400 MPa时，RCL活力下降明显加快。该结果表明一定压力下压力和温度共同促进了酶的热失活。

Boulekou等[12]发现在700 MPa、50 ℃处理1 min后，桃浆中的果胶甲酯酶残余活为80%左右；但在60 ℃下，果胶甲酯酶已经明显失活，该酶的残余活力降为40%。曾庆梅等[13]报道过氧化物酶活力与β-折叠有关，高压处理会减少该酶二级结构中的β-折叠含量，由此诱导酶失活；而温度与高压的共同作用会导致β-折叠含量减少，进而促使酶活下降。另一方面，Noel等[9]则发现即使在水相体系中超高压也可以提高R.miehei脂肪酶的稳定性，而且在达到变性温度50 ℃时，高压(50～350 MPa)能够保护脂肪酶的结构，并且随着温度的提高，这种保护效应越来越明显。这些研究表明高压—温度协同作用可能是通过酶构象的改变来调节酶催化行为。

2.4 温度—压力二元作用下的热变性动力学

上述研究结果表明，对于压力和温度共同作用下酶的稳定性，两者既可能表现为相互拮抗，也可能表现为相互促进，其中的解释与热变性动力学有关。

如果把酶的热失活(本质上是蛋白质的热变性)假设为一个双态模型：活性酶↔变性酶，这个过程的平衡常数Keq可以用下列公式表示：

(1)

式中：

[E]A、[E]D——分别表示活性酶与变性酶的浓度，mol/L；

[E]max——活性酶浓度的最大值，mol/L。

根据米氏方程，酶反应速率可以写为：

(2)

若[S]≫Km，则Km可以被忽略，此时反应速率接近于恒定值，反应为零级反应：

(3)

本研究中，酶活的测定均在常压、40 ℃下进行，k值恒定，因而反应速率v与活性酶浓度[E]成正比，式(1) 可以写成：

(4)

式中：

vmax——最适温度或压力下对应的反应速率，μmol/(mL·min)。

若活性酶↔变性酶的可逆变化处于平衡时，变性酶的含量为零，则Keq的值为0，由式(4)可推得v=vmax。找到常压下反应速率vmax的值所对应的温度值或者一定温度下反应速率vmax的值所对应的压力值即可得到100%活性酶的温度—压力二元相图。

本研究证实试验条件下RCL催化的橄榄油水解速率与底物浓度无关，并由此得到了vmax。本研究测定了RCL在不同温度及压力处理下的反应速率，vmax所对应的温度分别为10，15，20，25，30，35，40 ℃；而其所对应的压力分别为50，100，150，200，250，300 MPa，从而得到温度—压力二元相图，见图6。

图6中的椭圆代表了活性酶和变性酶的平衡。当温度和压力均位于椭圆之内，酶将处于活性状态；而当温度和压力处于椭圆外部时，酶则处于失活状态。由图6可知，对于右半支曲线上的A点，当压力提高时，同时需要进一步提高温度，才能使酶失活，说明温度和压力对酶活的影响存在拮抗效应，压力的提高可以将酶于高温下的稳定性提高。因此，可以通过适当的压力处理来改善酶的稳定性。

在高于42 ℃的温度下，改变压力已无法使该酶的状态回到椭圆内，此时，随着温度的提升，酶的状态偏离椭圆曲线的程度不断加剧，说明压力已经不足以抵抗热变性导致的酶构象变化。而当压力超过325 MPa时，也使酶的状态不断偏离椭圆曲线，压力的提升开始对酶的结构产生破坏，压力和温度之间表现为相互促进。

3 结论

高压处理能够改变华根霉脂肪酶的活力，但压力过高会引起该酶的失活，200 MPa是最适处理压力，在此压力下处理可使RCL的活力提高16%。高压处理并未改变RCL的最佳催化温度。另一方面，即使在最佳压力下，该酶的热失活现象依然存在。压力—温度协同作用下RCL的热稳定行为表明：200 MPa处理能够显著改善RCL的热稳定性，而较高压力将改变RCL的热失活动力学。在0.1～200.0 MPa范围内压力和温度之间存在拮抗效应，而当压力超过350 MPa后高压处理反而降低了RCL的热稳定性，即压力和温度之间呈现促进效应。建立活性酶↔变性酶的双态模型考察了RCL的热稳定性，本研究测得的椭圆曲线符合热力学理论推导的结果，同时也可以解释压力和温度协同作用下RCL的热稳定性行为。

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Study on catalytic behaviors ofRhizopuschinensislipase under synergic action of high pressure and temperature

CHEN Gang1MIAOMing2JIANGBo2FENGBiao1,2

(1.SchoolofFoodScience,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The effects of pressure and temperature on the activity and the stability ofRhizopuschinensislipase during high hydrostatic pressure treatment were studied. Based on the two-state model, the thermal denaturation of the enzyme was investigated and the isokineticity diagram was obtained. Within 0.1～200.0 MPa the enzyme activity increased with the pressure and the maximum activity was achieved at 200 MPa, which was 116% of that at atmospheric pressure. The activity began to decrease at pressure above 200 MPa and this tendency accelerated upon the pressure superior to 400 MPa. The high pressure treatment did not modify the optimal temperature of the enzyme. The enzyme exhibited the highest stability when it was treated at 200 MPa and 40 ℃. Its stability declined obviously when it was treated under pressure above 350 MPa. The above behavior could be explained by the isokineticity diagram.

high hydrostatic pressure; lipase; temperature; relative activity; thermostability；catalytic behavior；two-state model

教育部博士点基金(编号：20130093110010)

陈刚，男，江南大学在读博士研究生。

冯骉(1953—)，男，江南大学教授，博士生导师，博士。 E-mail：bfeng@jiangnan.edu.cn

2017-01-20

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.001