拟层孔菌属中7种羊毛甾烷型三萜抗肿瘤活性及构效关系研究

史帧婷+包海鹰+冯爽

[摘要]对拟层孔菌属中红缘拟层孔菌Fomitopsis pinicola和药用拟层孔菌F. officinalis子实体的7种羊毛甾烷型三萜类化合物fomitopsin C（1）、3-酮基-去氢硫色多孔菌酸（2）、去氢齿孔酮酸（3）、3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸（4）、松苓酸A（5）、栓菌酸（6）和齿孔酸（7）进行了分离纯化；体外抗肿瘤方面，采用MTT法测试7种单体化合物对人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞、人肝癌HepG2细胞和人肺癌A549细胞增殖的影响，结果表明7种化合物对MCF-7细胞较为敏感，对MCF-7半数抑制浓度IC₅₀为2<5<4<1<3<6<7；体内抗肿瘤方面，采用H22荷瘤小鼠模型，对比研究体外抗肿瘤活性较好的化合物2～5对小鼠的影响，结果表明化合物2和化合物4抗肿瘤活性好，并呈现一定的剂量依赖关系，化合物2， 4， 5剂量为20 mg·kg^-1时的抑瘤率分别为65.31%， 59.75%， 58.72%，接近阳性药组的抑瘤率69.19%；近一步试验表明抗肿瘤作用与抑制VEGF表达和免疫调节相关，对细胞因子IL-4和IFN-γ表达的影响较大，与抗氧化作用关联性较少，根据结果推断出羊毛甾烷型四环三萜结构抗肿瘤构效关系可能为，在3位羟基被酮基或乙酰基取代和C环中15位连有羟基时，此类化合物的抗肿瘤作用增强。

[关键词] 红缘拟层孔菌； 药用拟层孔菌； 羊毛甾烷型四环三萜； 抗肿瘤； 构效关系

[Abstract] Seven lanostane-type triterpenes including fomitopsin C（1），3-keto-dehydrosulfurenic acid（2），dehydroeburiconic acid（3），3-acetyloxylanosta-8， 24-dien-21-oic acid（4），pinicolic acid A（5），trametenolic acid B（6），and eburicoic acid（7），were isolated from the fruitbodies of Fomitopsis pinicola and F. officinalis. In vitro assay， all compounds were evaluated against MCF-7， HeLa， HepG2 and A549 cells lines using the MTT assay and the structure-activity relationship of antitumor activity was discussed. The results showed that the seven compounds were more sensitive to MCF-7 cells.The IC50 value for MCF-7 was 2<5<4<1<3<6<7. H22 tumor mouse model was used to assay compounds 2， 3， 4 and 5 in vivo. Compounds 2 and 4 had obvious effect and the necrosis area and measurement were positively correlated. The results showed that compounds 2， 4 and 5 had significant antitumor activities at a dose of 20 mg·L^-1with 65.31%， 56.71%， 58.72% suppression， respectively， approaching to CTX group with 69.19% suppression in subcutaneous H22-implanted mice.The results showed that these compounds had significant against the expression of VEGF，cytokines IL-4 and IFN-γ tumor， additionally， the structure-activity relationship of lanostane-type triterpenes indicated that the acetoxyl or carbonyl at C-3 and hydroxy at C-15 can enhance the antitumor activity.

[Key words] Fomitopsis pinicola； Fomitopsis officinalis； lanostane-type triterpenes； antitumor； structure-activity relationship

癌癥疾病人们谈之色变，它是人类健康的主要威胁之一，其分布广、患者多，目前各国学者对其研究一直火热，本研究以隶属于真菌界Fungi，担子菌门Basidiomycota，担子菌纲Basidiomy cetes，多孔菌目Polyporales，多孔菌科Polyporaceac拟层孔菌属Fomitopsis红缘拟层孔菌F. pinicola和药用拟层孔菌F. officinalis子实体为试验原材料^[1]，红缘拟层孔菌其味微苦、性平，具滋补强壮、扶正培本、祛风除湿、安神定志和强心等作用，在东北地区民间当作“桑黄”药用^[2]，赵兴华等^[3-5]研究表明其子实体和发酵产物氯仿提取物均具有较高的抑瘤率，能够显著地延长小鼠的生存率，并证明了3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸和松苓酸A为其活性成分。药用拟层孔菌在新疆被称为“阿里红”，是维吾尔医常用的民族药材，用于治疗腹痛、感冒、肺结核患者盗汗和慢性气管炎^[6]。研究表明其子实体乙酸乙酯提取层具有非常好的抗肿瘤活性及提高机体免疫力的活性，进一步研究表明3-酮基-去氢硫色多孔菌酸，去氢齿孔酮酸为其活性成分^[7-8]。本研究在前人研究的基础上，分离得到的7种羊毛甾烷型三萜类化合物：fomitopsin C（1）、3-酮基-去氢硫色多孔菌酸（2）、去氢齿孔酮酸（3）、3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸（4）、松苓酸A（5）、栓菌酸（6）和齿孔酸（7），进行了体内外的抗肿瘤实验，并对其构效关系进行了分析。

1 材料

原材料：药用拟层孔菌子实体F. officinalis采自内蒙古阿尔山，红缘拟层孔菌子实体F. pinicola采自吉林省长白山，均由吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心图力古尔教授鉴定。

瘤株：人乳腺癌细胞 MCF-7、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞 HepG2和人肺癌细胞A549均由吉林大学基础医学部药理实验室提供。

实验动物：清洁级昆明种小鼠，雌性，5～6 周龄，体重18～22 g，由吉林大学实验动物中心提供，许可证号SCXH-（吉）2015-0067。

万能高速粉碎机（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、 N-1200B型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、 A-1000S型循环水真空泵（上海爱朗仪器有限公司）、 DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、RY-2型显微熔点检测仪（天津市国铭医药设备有限公司）、 AUY电子分析天平（日本SHIMAOZU公司）、 WFH-308B手提式紫外分析仪（上海精科实业有限公司）、SB-54原子吸收分光光度计（Avanta PN GBC，Australia）、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、甲醛（北京化工厂）、MCO-15AC型CO₂培养箱（SANYO）、A-5082酶标仪（Sunrise）；新生牛血清（杭州四季青公司）；青霉素和链霉素（华北制药有限公司）；RPMI-1640培养基，DMEM培养基，MTT （Sigma），A-5082酶标仪（Sunrise），RM2016型石蜡切片机（Leica），TGL-16C离心机（上海安亭科學仪器厂），高效切片石蜡（上海华永石蜡有限公司），HE染色材料（上海远慕生物科技有限公司），MDA，SOD， CAT，GSH-Px，IL-2，IL-4 试剂盒（南京建成生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 化合物的提取、分离和纯化

药用拟层孔菌子实体阴干（5 kg），粉粹后置于提取罐中，利用冷凝回流法，依次使用石油醚（60～90 ℃）提取温度 65 ℃、乙酸乙酯提取温度80 ℃分别提取3次，减压浓缩分别合并浸膏，得到石油醚层（150 g）和乙酸乙酯层浸膏（820 g），将2层提取物浸膏分别用适量80～100目硅胶拌样，干样上200～300目及300～400目硅胶柱多次，用石油醚-乙酸乙酯（200∶1～1∶1），石油醚-丙酮（30∶1～1∶1），二氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）洗脱剂系统进行多次梯度洗脱，从石油醚层得到化合物1（60 mg），乙酸乙酯层得到化合物2（1 146 mg）和3（2 582 mg）。红缘拟层孔菌（5 kg）经过同上方法，得到石油醚层（200 g）和乙酸乙酯层浸膏（790 g），从石油醚层中得到化合物4（400 mg），乙酸乙酯层中得到化合物4（1 164 mg）和5（1 132 mg），经过高效液相制备得到化合物6（98 mg）和7（131 mg），通过重结晶等方法对得到的7个化合物进行纯化。

2.2 体外抗肿瘤活性研究

本研究采用MTT法检测细胞的存活率，将人乳腺癌细胞 MCF-7、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞 HepG2和人肺癌细胞A549的细胞保存管从液氮中取出，迅速转移到37 ℃ 恒温水域中，不断振摇直至完全溶解，置于1 000 r·min^-1离心机中，离心10 min，无菌条件将细胞冻存液倒出，移入1 mL完全培养液，轻轻吹打使细胞悬浮，然后转移到培养瓶中，再向培养瓶中加入4 mL完全培养液，在倒置显微镜下观察细胞形态，如有细胞团快，轻轻吹打使细胞，使呈单个细胞分散状态，瓶口半旋置于细胞培养箱中，培养条件为 5% CO₂，37 ℃和饱和湿度；4种细胞均为贴壁细胞，每隔12 h将细胞培养瓶置于倒置显微镜下观察细胞的生长状态，当细胞培养瓶底部有80%的面积有细胞附着生长时，弃去培养液，用PBS缓冲液冲洗2次，弃去PBS缓冲液，加入2 mL胰酶，置于倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞变成圆粒形，轻轻敲打瓶壁，加入1 mL完全培养液，终止消化，并移入到无菌离心管中，1 000 r·min^-1离心5 min，倒去上清，用1 mL完全培养液轻轻吹悬，并移入到培养瓶中，向培养瓶继续中加入4 mL完全培养液，轻轻吹打使细胞，使呈单个细胞分散状态，瓶口半旋置于细胞培养箱中继续培养，培养条件为同上；将传够3代的单个细胞悬液（6×10⁴个/mL）接种于96孔板上，每孔100 μL。在培养箱（37 ℃，5% CO₂）中培养24 h后分别加入化合物1～7的不同浓度待测样品，终质量浓度分别为1.56，3.13，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 mg·L^-1，每组设5个复孔，继续培养48 h，于培养结束前4 h，每孔加入20 μL的MTT 溶液（5 g·L^-1）。终止培养，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。在570 nm处用酶标仪测定各孔吸光度值（A），记录结果，采用 SPSS 19.0 对数据进行统计分析，计算细胞增殖抑制率及半数抑制浓度（IC₅₀）。

2.3 体内抗肿瘤活性研究

体内实验接近生理条件更能反映出药物对机体的综合作用，萜类化合物发挥抗肿瘤的药理作用基本途径一般有3种：①抑制癌细胞生长；②免疫调节；③对抗自由基。本研究选择体外抑瘤作用较好的化合物2～5，检测对H22荷瘤小鼠的影响，通过肿瘤的大小，肿瘤切片细胞的形态的变化，肿瘤匀浆液中血管内皮生长因子VEGF 的含量，检测4种单体化合物对实体肿瘤本身的影响；通过检测荷瘤小鼠的免疫器官指标及血清中免疫因子IL-2，IL-4，IFN-γ，TNF-α 含量的变化，探讨4种化合物对荷瘤小鼠免疫系统的影响；通过检测荷瘤小鼠肝脏组织匀浆液中MDA，SOD酶，CAT酶，GSH-Px酶含量水平的改变，初步探讨4种化合物对荷瘤小鼠抗氧化功能方面的作用。

参照池梦怡^[8]试验方法，建立小鼠H22腹水瘤模型，给药体积为20 mL·kg^-1，阳性组腹腔注射环磷酞胺（CTX），质量分数为20 mg·kg^-1，每48 h 1次；阴性组灌胃生理盐水20 mL·kg^-1，每24 h 1次；供试组灌胃给药化合物2～5，其中高剂量组为20 mg·kg^-1，中剂量组为10 mg·kg^-1，低剂量组为5 mg·kg^-1，每隔24 h 1次。连续10 d后禁食禁水12 h，第11天小鼠眼球靜脉取血静置30 min，2 000 r·min^-1低温离心15 min，取血清，利用ELISA法测免疫因子IL-2，IL-4，TNF-α，IFN-γ的含量，后处死小鼠，取脾脏、胸腺、瘤块，称重，计算胸腺指数、脾指数和抑瘤率；每组随机选取5个瘤块用4 %甲醛固定，待做肿瘤切片用，剩余瘤块-80 ℃保存，待测瘤块中的VEGF；取肝脏，待测肝脏中MDA，SOD酶，CAT酶，GSH - Px酶的含量，对结果进行分析。

抑制率=1-给药组瘤质量模型组瘤质量×100%

胸腺（脾）指数=1 000×胸腺（脾）质量体重

3 结果与分析

3.1 化合物的结构鉴定和纯度检测

MS，¹H-NMR，¹³C-NMR结合COSY，HSQC，HMBC，ROESY谱图化合物1～7分别为fomitopsin C^[9]，3-酮基-去氢硫色多孔菌酸^[10-11]，去氢齿孔酮酸，3-乙酰氧基-8，24-羊毛甾二烯-21-酸^[12]，松苓酸A^[13]，栓菌酸^[12]，齿孔酸^[14]。经高效液相色谱法检测，7种纯化后的单体化合物纯度均在95%以上。

3.2 体外抗肿瘤活性研究

7种化合物对人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞、人肝癌HepG2细胞和人肺癌A549抑制细胞增殖的作用，见图1。化合物2对4种瘤细胞的抑制作用较强，化合物6和化合物7对4种细胞的抑制作用较弱。

采用SPSS 19.0软件对不同浓度化合物抑瘤率曲线进行拟合，见表1。

7种化合物对MCF-7细胞较为敏感，对MCF-7半数抑制浓度IC₅₀分别为化合物2<化合物5<化合物4<化合物1<化合物3<化合物6<化合物7。

3.3 体内抗肿瘤活性研究

3.3.1 H22对荷瘤小鼠肿瘤的影响 肿瘤的大小可以直接反映出药物的抑瘤效果，见表2，4种单体化合物对H22荷瘤小鼠肿瘤都有一定的抑制作用，并呈一定的量效关系，其中化合物2>化合物4>化合物5>化合物3，化合物2高剂量的抑瘤率达到了65.31%，化合物4高剂量的抑瘤率达到了59.75%，接近阳性药环磷酰胺的抑瘤率69.19%。

通过观察HE染色的H22实体瘤组织切片细胞形态，可以从细胞水平反映药物对肿瘤的影响，将肿块石蜡包埋、切片、HE 染色后置于光镜下观察（×200）肿瘤细胞形态学的变化，结果见图2，可知模型组小鼠肿瘤细胞生长旺盛，细胞核大，排列紧密，细胞膜完整，坏死区少见；用药组肿瘤细胞呈局灶性或大片状坏死，可见大面积红染的坏死区，肿瘤组织的排列疏松，肿瘤细胞失去常规形态，并且肿瘤坏死区的面积与剂量呈正相关。由此推断，4种化合物可以使肿瘤细胞变形、坏死及生长受到抑制。

利用面积检测软件Motic Images Advanced 3.2对切片中坏死区进行面积检测分析，结果见表3，综合比较肿瘤坏死面积化合物2>化合物4>化合物5>化合物3，坏死面积大小与用药剂量呈现正相关，与对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用结果相符。

癌症的增长、入侵和转移与血管生成密不可分，VEGF家族参与了血管的形成过程，并且大多数的实体肿瘤都表现出血管内皮生长因子的超表达^[15-17]，与模型组相比，4种化合物的高剂量组对小鼠肿瘤中VEGF有明显的抑制作用，可以有效地降低VEGF的表达，化合物2和化合物4的抑制作用较好，高剂量组可以明显降低小鼠肿瘤中VEGF的含量，并且存在一定的量效关系，由此推断4种化合物抗肿瘤作用与抑制VEGF的表达相关，可能是通过干扰VEGF的表达这一途径来影响血管的形成，从而达到抗肿瘤的目标见表4。

3.3.2 H22对荷瘤小鼠免疫系统的影响 脾脏与胸腺是机体重要的免疫器官，参与调解机体的免疫反应，见图3，4，模型组与正常对照组相比，胸腺指数与脾脏指数指数明显升高，有可能说明小鼠在这阶段正处于免疫亢进状态；而与模型组相比，化合物2和化合物3的高剂量组可使脾脏指数降低，低剂量组没有使脾脏指数降低，反而明显升高，由此可以初步推断化合物2和化合物3为免疫增强剂，但达到一定的剂量时，可能有免疫抑制作用；化合物4的作用趋势与阳性药相似，说明化合物4可能为免疫抑制剂。

血清中的细胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ和TNF-α在精密调节机体自身免疫功能过程中起主要作用，其中IL-4已经被公认为是负向免疫调节细胞因子，抑制其他炎性因子的长生，与肿瘤免疫息息相关^[18]，IFN-γ能诱导细胞凋亡和抑制细胞周期的进展，并控制Th1 / Th2的平衡^[19]。

与空白对照组相比，模型组小鼠血清中的IL-4值升高，IFN-γ的值降低；与模型组相比，各给药组的IL-4含量均有不同程度的下降，而化合物2，4，5的高剂量组IFN-γ含量有显著性升高（P<0.01）；4种化合物对细胞因子IL-2和TNF-α的表达影响较小，见表5。

3.3.3 H22对荷瘤小鼠抗氧化功能的影响 氧化应激反应与肿瘤密切相关，参与肿瘤发生、发展、预防和治疗的各个阶段^[20]，肿瘤患者机体中氧化还原酶系统（包含的酶有CAT，SOD，GSH-Px及GR等^[21-22]）不能对肿瘤细胞活性氧的产生进行正常的调控，而活性氧的增多可增强脂质过氧化反应，产生有害的氧化产物，如MDA^[23]。本研究对4种化合物作用到H22荷瘤小鼠后，肝脏中CAT，SOD，GSH-Px 3种酶水平及MDA含量的进行了检测，见表6，与模型相比，各给药組的MDA含量均有不同程度的下降，而各化合物高剂量组的MDA含量显著性降低（P<0.05）；与模型组相比，各给药组对SOD和CAT含量水平影响小，只有化合物2中剂量和化合物5高剂量组显著性升高（P<0.05）；与模型组及环磷酰胺组相比，各给药组GSH-Px含量均升高，各化合物的高剂量组GSH-Px的含量显著性升高（P<0.05），结果显示，4种化合物对CAT酶和SOD酶几乎没影响，仅高剂量组可以降低MDA含量，升高GSH-Px的水平，推断4种化合物的抗肿瘤作用的机制与抗氧化作用关联性较少。

3.4 构效关系分析

本研究对分离的7种羊毛甾烷型三萜类化合物进行了初步的构效关系讨论，化合物1，4～7结构中8，9位碳是双键，化合物2，3母核结构中的双键位置是7，9（11）共轭结构，2类物质的IC₅₀没有特别明显的差异，故在体外抑瘤作用中，母核上双键的位置对抗人肝癌HepG2功效影响较小。化合物2在结构上比化合物3在15位多了1个羟基，而化合物2，3的抗肿瘤活性差别较大，说明C-15位置上的羟基有助于化合物抗肿瘤活性的增强。化合物4在3位有乙酰氧基，IC₅₀较小，说明3位酯基取代能增强抗肿瘤活性。化合物1的13位羟基与26位羧基发生分子内酯化，在13位形成聚酮结构，化合物1的IC₅₀较大，分子间酯化对抗肿瘤作用的影响还有待进一步研究。化合物2与化合物3相比较，结构上仅在15位多1个羟基，化合物4与化合物5相比较，结构上仅是3位取代基不同，体内抗肿瘤构效研究表明，在肿瘤抑制率、抑制VEGF表达方面，3位是乙酰氧基，C环中15位连有羟基可以增强抑制肿瘤的效果。化合物2与化合物3对免疫器官的影响趋势相似，化合物2和化合物3母核结构中的双键位置是7，9（11）共轭结构，并且侧链双键为24与31位碳形成的双键，故在体内抑瘤作用中，结构上双键的位置可能影响着荷瘤小鼠的免疫调节功能。

4 讨论

关于羊毛甾烷型三萜的抗肿瘤构效关系及机制研究目前还处于初期阶段，本研究采用MTT法测试了7种羊毛甾烷型三萜类化合物对MCF-7细胞、Hela细胞、HepG2细胞和A549细胞增殖的影响，对其构效关系进行了分析，并选取了体外活性较好的单体化合物2～5，以移植实体瘤、免疫器官、细胞因子和肝脏酶系作为考察指标，研究4种化合物对H22荷瘤小鼠的整体影响，初步探索了4种化合物在体内抗肿瘤方面与结构是否存在一定的关联性以及抗肿瘤的作用机制。结果表明，7种化合物对MCF-7细胞较为敏感，化合物2～5可以使肿瘤细胞变形、坏死及生长受到抑制，对细胞因子IL-4和IFN-γ表达的影响较大，其抗肿瘤作用与抑制VEGF表达和免疫调节相关，可能是通过干扰VEGF的表达及免疫调节这一途径，来影响血管的形成和提高机体的免疫力，从而达到抗肿瘤的目标，抗肿瘤作用的机制与抗氧化作用关联性较少。体内抗肿瘤构效研究表明，在肿瘤抑制率和抑制VEGF表达方面，3位是乙酰氧基，C环中15位连有羟基可以增强抑制效果，与体外抗肿瘤构效关系相近；另外，在调节脾脏指数方面，母核为7，9（11）共轭结构，侧链为24（31）-烯-21酸的化合物表现出构效关系倾向。综合研究结果表明，其中3位羟基被酮基或乙酰基取代与15位连有羟基可以增强抑瘤作用，这一构效关系在体内外抗肿瘤方面均成立，其中化合物2和化合物4的体外体内抗肿瘤活性好，有进一步开发和研究的价值。本研究为多孔菌的研究开发和羊毛甾烷型三萜作为天然抗肿瘤药物等研究奠定了基础，为4种化合物在抗肿瘤作用方面的继续研究提供一定的研究基础，为羊毛甾烷型三萜化合物及其衍生物药理活性和构效关系的研究提供了参考。

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[责任编辑 丁广治]