VEGF-C在口腔颌面部淋巴管瘤组织中表达变化及其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

王国云，杨旭，徐天舒

(常州市第一人民医院，江苏常州213000)

VEGF-C在口腔颌面部淋巴管瘤组织中表达变化及其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

王国云，杨旭，徐天舒

(常州市第一人民医院，江苏常州213000)

目的探讨血管内皮生长因子C(VEGF-C)在口腔颌面部淋巴管瘤(OML)发生、发展中的作用。方法收集OML组织(OML组)和瘤旁正常组织(Control组)各54例份，采用qRT-PCR法检测组织中VEGF-C mRNA相对表达量，采用免疫组化法检测VEGF-C蛋白阳性表达率。将体外培养的人脐静脉内皮细胞ECV304随机分为两组，分别转染sh-VEGF-C质粒(观察组)和对照质粒sh-control(对照组)，转染48 h时，分别采用qRT-PCR法和Western blotting法检测VEGF-C mRNA和蛋白相对表达量，采用MTT法检测细胞增殖能力(以吸光度值表示)。结果OML组与Control组VEGF-C mRNA相对表达量分别为1.061±0.284、0.801±0.098，VEGF-C蛋白阳性表达率分别为84.10%(42/54)、10.13%(5/54)，两组比较P<0.05或<0.01。观察组与对照组VEGF-C mRNA相对表达量分别为0.200±0.058、0.967±0.017，VEGF-C蛋白相对表达量分别为0.319±0.021、0.965±0.039，吸光度值分别为0.393±0.015、0.975±0.004，两组比较P均<0.01。结论VEGF-C在OML组织中高表达；降低VEGF-C表达可抑制人静脉内皮细胞增殖。

口腔颌面部淋巴管瘤；血管内皮生长因子C；人脐静脉内皮细胞；细胞增殖

口腔颌面部淋巴管瘤(OML)是高发于面部皮肤、口腔黏膜及皮下组织等头颈部多个部位的淋巴管病变，在儿童中发病率较高[1]。淋巴管的形成由多种促进因子和抑制因子共同调控，两者平衡一旦被打破，内皮细胞数量发生改变，可能导致淋巴管瘤或脉管畸形[2]。恶性肿瘤转移与增殖常依赖于淋巴管的转运。血管内皮生长因子C(VEGF-C)是重要且特异的促淋巴管形成内皮生长因子，已被证实在多种恶性肿瘤如乳腺癌、胃癌中异常表达，与肿瘤转移和恶性进展密切相关[3,4]。目前关于VEGF-C与OML的关系鲜见报道。为此，我们于2015年7月～2016年12月进行了本研究，旨在探讨VEGF-C在OML发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 ①组织样本：收集我院病理科存档的54例OML患者的瘤组织标本(OML组)及瘤旁正常组织标本(Control组)。OML患者男27例、女27例，年龄0.3～32(11.4±10.5)岁，口腔颌面部毛细管型淋巴管瘤、海绵状淋巴管瘤和囊肿淋巴管瘤各18例。患者术前均未接受硬化等治疗。②细胞：人脐静脉内皮细胞ECV304，中国科学院上海生命科学院生化与细胞生物学研究所。将ECV304细胞置于含10% FBS的RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱内孵育。当细胞融合度达80%～90%时收集细胞，用含10% FBS的RPMI 1640培养基稀释，制备密度为5×104个/mL的细胞悬液，按每孔2 mL接种至6孔板。细胞融合至60%～80%时随机分为两组，分别转染质粒sh-VEGF-C(观察组)及sh-control(对照组)。③主要试剂：兔抗人VEGF-C单抗和兔抗人GAPDH多抗(美国CST公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；VEGF-C抑制性慢病毒载体质粒sh-VEGF-C及对照空载体质粒sh-control(美国GeneCopoeia公司构建)；Lipofectamine 2000转染试剂、TRIzol(美国Invitrogen公司)，TaqMan逆转录试剂盒(美国Life Technologie公司)，qSYBR-Green-containing PCR kit试剂盒(美国GeneCopoeia公司)，两步法免疫检测试剂盒(美国Dako公司)，MTT细胞生长增殖/毒性检测试剂盒(美国Sigma公司)。

1.2 组织标本VEGF-C表达检测 ①VEGF-C mRNA表达检测：采用qRT-PCR法。取OML组和Control组标本，TRIzol法提取RNA，逆转录生成cDNA；以cDNA为模板，参照qRT-PCR说明书进行PCR扩增，检测CT值。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算VEGF-C mRNA相对表达量。②VEGF-C蛋白表达检测：采用免疫组化法。取OML组和Control组标本，常规石蜡包埋后切片，梯度乙醇脱蜡。抗原修复，血清封闭，滴加VEGF-C抗体(1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗5 min×3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min；显色剂显色后苏木精复染，中性树胶封片；显微镜下(×200)采集图像。VEGF-C蛋白主要表达于细胞质，以阳性细胞在全部细胞中所占比例和阳性细胞染色强度综合判定结果：A：阳性细胞数<1/3为1分，1/3～<2/3为2分，≥2/3为3分；B：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。A×B=0判断为-，1～2为+，3～4为++，5～9为+++。+、++、+++均为阳性，统计阳性表达率。

1.3 细胞VEGF-C表达及细胞增殖能力检测 ①VEGF-C mRNA表达：采用qRT-PCR技术。TRIzol法提取稳定转染48 h的观察组和对照组细胞RNA，检测VEGF-C mRNA相对表达量，具体步骤参照1.2中①。②VEGF-C蛋白表达：采用Western blotting法。取稳定转染48 h的观察组和对照组细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。分别取30 μg样本进行10% SDS-PAGE。将蛋白转移至PVDF膜上，5% BSA室温封闭1～2 h，加入1∶1 000的兔抗人VEGF-C和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜后TBST洗膜，1∶2 000羊抗兔二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL发光剂并用X片曝光、显影、定影、扫描，保存条带图片。采用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值和内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。③细胞增殖能力：采用MTT法。将稳定转染48 h的观察组和对照组细胞接种到96孔板，当细胞融合至接近90%时，每孔加入灭菌MTT液30 μL(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h；每孔加入150 μL DMSO，低速振荡10 min；采用酶标仪检测570 nm波长处各孔吸光度(A)值。

2 结果

2.1 OML组与Control组VEGF-C表达比较 OML组与Control组VEGF-C mRNA相对表达量分别为1.061±0.284、0.801±0.098，两组比较P<0.05。VEGF-C蛋白阳性表达主要定位于细胞质，少量见于细胞膜，OML组及Control组VEGF-C蛋白阳性表达率分别为84.10%(42/54)、10.13%(5/54)，两组比较P<0.01。

2.2 观察组与对照组VEGF-C表达及细胞增殖能力比较 观察组与对照组VEGF-C mRNA相对表达量分别为0.200±0.058、0.967±0.017，VEGF-C蛋白相对表达量分别为0.319±0.021、0.965±0.039，A值分别为0.393±0.015、0.975±0.004，两组比较P均<0.01。

3 讨论

OML是由淋巴管扩张或增生而成的口腔颌面部常见良性肿瘤，可造成由内皮细胞排列的管腔内充满大量淋巴液，且一般不会自行消退[5,6]；临床上多采用冷冻治疗、硬化治疗、放疗、化疗或手术治疗等，以手术治疗为主。近年来平阳霉素瘤内注射，同时针状型微波辐射器刺入瘤内热凝等方法应用于治疗OML，虽治疗效果明显提升，但易导致内皮增生等多种不良反应[7,8]。血管新生及内皮增生均需要多种生长因子和细胞因子的共同作用才可实现，其中VEGF家族可直接或间接调控血管或淋巴管生成，提高血管通透性并诱导内皮细胞分裂和增殖[9]。VEGF是目前促血管生成作用最为显著的生长因子，为多功能的细胞因子家族，其家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PIGF)。其中VEGF-C在人类胚胎组织及成熟组织中均存在，其分布特点是外周血白细胞、胸腺、肝脏和脑中表达量较低，心脏、卵巢、胎盘和小腺体中表达量较高[10,11]。

本研究结果显示，OML组织中VEGF-C mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率均显著高于正常组织，即VEGF-C在OML患者瘤组织中高表达，提示VEGF-C高表达促进OML的发生[12,13]。ECV304细胞可通过自发转化获得，细胞生长时呈单层鹅卵石状，具有接触抑制效应，且培养时不需要添加任何特殊的生长因子即可获得良好的生长状态，是理想的OML研究模型。本研究分别转染VEGF-C的抑制质粒sh-VEGF-C及其对照质粒sh-control到ECV304细胞中，MTT法检测细胞增殖能力，结果显示抑制VEGF-C表达可显著降低ECV304细胞的增殖能力，提示VEGF-C具有抑制细胞增殖、促进血管内皮细胞有丝分裂的作用[14]。VEGF及血管内皮生长因子受体(VEGFR)可构成VEGF/VEGFR生物轴，该生物轴由多重受体和配体相互叠加构成，由于受体和配体的结合具有专一性，因此不同细胞中VEGF/VEGFR表达和功能各不相同，VEGF信号被激活时，可触发信号通路的网状传导，最终促进血管内皮细胞生长、增殖及转移[15]。因此，在VEGF-C信号被抑制时其下游信号通路的传导也被阻断，从而抑制血管内皮细胞生长增殖。

综上所述，VEGF-C在OML组织中高表达；抑制VEGF-C表达可抑制人静脉内皮细胞增殖。VEGF-C高表达可能参与了OML的发生、发展。

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ExpressionofVEGF-Cinoralandmaxillofaciallymphangiomaanditseffectonproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcells

WANGGuoyun,YANGXu,XUTianshu

(ChangzhouFirstPeople′sHospital,Changzhou213000,China)

ObjectiveTo explore the expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) in the occurrence and development of oral and maxillofacial lymphangioma (OML).MethodsThe tumor tissues (OML group) and the adjacent normal tissue (control group) from OML patients were collected. The real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of VEGF-C mRNA in the tissues. Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the positive rate of VEGF-C protein expression in the tissues. ECV304 cells cultured in vitro were randomly divided into two groups: the observation group which was transfected with sh-VEGF-C plasmid and the control group transfected with control plasmid sh-control. After 48-hour transfection, qRT-PCR and Western blotting were used to detect the relative expression of VEGF-C protein, and MTT assay was used to detect the proliferation of the cells (absorbance value).ResultsIn the OML group and control group, the expression of VEGF-C mRNA was 1.061±0.284 and 0.801±0.098, respectively; the positive expression rates of VEGF-C protein was 84.10% (42/54) and 10.13% (5/54), respectively (P<0.05 orP<0.01). In the observation group and control group, the relative expression levels of VEGF-C mRNA were 0.200±0.058 and 0.967±0.017, respectively; the relative expression levels of VEGF-C protein were 0.319±0.021 and 0.965±0.039, respectively; the A values were 0.393±0.015 and 0.97±0.004, respectively; significant differences were found between these two groups (allP<0.01).ConclusionsVEGF-C is highly expressed in the OML tissues, and decreasing VEGF-C can inhibit the proliferation of human umbilical vein endothelial cells.

oral and maxillofacial lymphangioma; vascular endothelial growth factor-C; human umbilical vein endothelial cells; cell proliferation

江苏省科学技术奖资助项目(2016562)。

王国云(1980-)，男，主治医师，研究方向为口腔颌面部肿瘤整复治疗。E-mail： chenzehui9578@qq.com

杨旭(1983-)，男，主治医师，研究方向为口腔颌面部恶性肿瘤整复治疗。E-mail： lihunzhinan@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.007

R739.81

A

1002-266X(2017)44-0026-03

2017-07-05)