DNA甲基化在中医药研究中的应用＊

陈光，王阶

DNA甲基化在中医药研究中的应用＊

陈光1,2，王阶1＊＊

（1.中国中医科学院广安门医院北京100053；2.北京中医药大学研究生院北京100029）

DNA甲基化是表观遗传学的经典调控机制，可调控转录水平。目前其在中医领域的研究主要包括证候相关生物标志物的初步研究，即探讨特定疾病的证候与特定基因甲基化的相关性，以及药物分子作用机制研究，即探讨中医药干预对特定基因甲基化程度变化及甲基化相关酶的影响。目前认为，甲基化调控具有遗传性、可塑性，并在整个基因组均有分布，可以适应中医证候动态演变与中医整体干预的研究特点。但目前的研究在证候相关生物标志物的方法学方面有待完善，在甲基化机制方面有待功能学验证的深入研究。甲基化在诠释中医先天遗传因素与后天环境影响对疾病与证候发生发展方面，甲基化与RNA层面的相互作用在探索中药干预机制方面，以及甲基化证候生物标志物在人群的证候筛查、疾病证候分型、药物敏感性的预测方面，均有广阔前景。

DNA甲基化中医药证候机制

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。从分子角度，表观遗传学是在同一基因组上建立并将不同基因表达（转录）模式和基因沉默传递下去的染色质模板变化的总和[1]。表观遗传学建立于对意外发现现象的理解，其机制具有遗传性和可塑性。DNA甲基化就是表观遗传中的典型现象之一。本文就DNA甲基化的基本研究方法及在中医药领域研究中的应用进行综述。

1 DNA甲基化基础

1.1 DNA甲基化基本概念

在哺乳动物中，DNA甲基化是由甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）所催化，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylMethionine，SAM）作为甲基供体，将甲基主要转移到CpG双核苷酸序列的胞嘧啶第五号碳原子上，也有少量转移到如CHG、CHH等非CpG的胞嘧啶上。

甲基化DNA在复制过程中，DNA会出现半甲基化状态，而DNMT1负责DNA复制中的甲基化维持，UHRF1负责识别半甲基化的DNA，并招募DNMT1。因为复制过程中DNMT1功能的缺失，则出现DNA被动的去甲基化现象。而主动的去甲基化过程可能的方式主要包括：糖苷酶特异识别5 mC，切除后进一步被BER通路修复为C；存在脱氨酶特异识别5 mC，C变成T后形成GT错配；NER通路直接切掉5 mC；5 mC通过氧化作用将甲基氧化成羧基，再通过脱羧酶的脱羧作用达到去甲基；水解作用直接去掉甲基基团[2]。其中，氧化方式中TET蛋白发挥着重要作用，而TET1则富集在TSS附近和CGI上，是该区域维持低甲基化的机制之一。因此，可见DNA甲基化处于甲基化和去甲基化的动态过程中，在复制过程中存在遗传性，但在动态变化中又具有可塑性。

1.2 DNA甲基化调控功能

DNA的甲基化修饰使DNA结合蛋白的部位——DNA双螺旋凹槽的外形发生改变，从而导致其与DNA结合蛋白的结合能力降低，影响识别转录因子，从而调节转录[3]。另外，DNA甲基化也可结合蛋白，通过影响结合的蛋白，从而对转录进行调控。

不同区域的DNA甲基化的功能不尽相同，TSS和启动子区甲基化与基因的转录抑制相关；在gene body上的甲基化则与转录剪接有关；重复序列、异染色质区域和转座子的转录抑制、基因组的稳定性有关；涉及基因印记则与X染色体失活有关。

在人的生命中存在两次重大的去甲基化过程，一次发生在形成成熟配子的过程中，一次发生在胚胎发育受精卵分化为干细胞的过程中，前者为了重新建立印记，而后者为了减弱印记，建立新的印记。

一些疾病与DNA甲基化密切相关，如X连锁的MeCP2突变导致Rett综合征，X连锁的红绿色盲以及癌症。异常的低甲基化导致原癌基因的过度表达与异常的高甲基化导致抑癌基因被沉默都可能是癌症发生的机制之一。

可见，DNA甲基化的调控方式在基因组中分布广泛，发挥的功能多样，又在胚胎发育过程中带有先天的印记。

1.3 DNA甲基化研究方法

在DNA甲基化的现代研究方法中，基于LC-MS/ MS液相色谱串联质谱分析5 mC/5 hmC的含量，可以确定总甲基化相对比例，但无法定位；针对特定位点的经典亚硫酸盐测序方法是金标准。对于芯片检测或测序方法而言，分为基于抗体、标记等亲和富集的方法（如MeDIP-seq）和BS处理单碱基分辨率的方法，前者对通量要求不很高，适合全基因组范围筛查，同时分辨率也受到限制，而后者又分为全基因组测序和RRBS，全基因组BS测序对测序深度要求较高，而RRBS则集中在富含CpG的区域，降低了测序成本。

另外，Hairpin BS-seq可以同时测两条链的甲基化，从而计算甲基化在复制过程中保留有效率。而TAB-Seq的特点则在于可以区分hmC，亚硫酸盐处理原理的检测则不能区分5mC和5-hmC。在研究过程中，可以根据实验设计的目标不同，选择不同的方法或方法组合。

2 中医药领域DNA甲基化研究现状

2.1 中医药相关组学研究背景

目前中医药在基因组学和后基因组学领域的研究主要涉及早期大量的SNP的GWAS研究、转录组学研究（早期以mRNA差异表达谱为主，最近以研究miRNA、lncRNA、circRNA为热点）、表观遗传学（以DNA甲基化为主）以及最新个别的研究肠道微生物相关的宏基因组学。

因为中医学认为“证候”是疾病某一阶段本质变化的体现，并据此进行治疗。所以，中医很大程度的研究是围绕证候进行的。研究方法基本为根据疾病和证候的不同组合进行分组，通过小样本量组间比较寻找某一组学的差异，对差异再进行大样本量的RT-PCR验证，如果涉及多个组学层面，则进行共表达分析，通过生物信息学推测与疾病和证候联系相对密切的差异，以及不同层面的上下游关系和网络调控关系，并通过动物和细胞实验进行功能学验证。这类研究往往同时再进行药物干预，观察药物对差异基因的影响，以及与患者症状、体征以及其他常规指标的相关性。

前一部分差异的筛选主要目的是寻找证候相关的生物标志物，中医的诊疗本就具有个体性，而生物标志物的研究为中医药实现现代的精准医疗奠定基础；后一部分聚类差异深入研究主要是为寻找关键调控节点及药物分子靶标，为阐明药物作用机制及研发中药新药提供思路。其过程中，利用的高通量技术基本以组合应用形式，先用芯片或二代测序小样本大范围筛选，再PCR验证，当然随着单细胞测序和三代测序的发展，其在中医药研究中的作用也将逐渐发挥优势。

2.2 中医证候相关研究

大部分中医药甲基化研究集中在对于某种特定疾病的证候与甲基化的相关性进行探讨。研究可以针对某特定基因甲基化进行研究。如一项急性髓系白血病中医证型与ID4基因启动子区甲基化相关性研究[4]发现，各证型患者ID4基因启动子区甲基化阳性率由低到高依次为气阴两虚证＜瘀血痰结证＜毒热炽盛证，差异均有统计学意义（P＜0.05）。对于中晚期非小细胞肺癌MGMT基因甲基化表达与中医证型的相关性研究发现，肺脾气虚证、肺阴虚证、气滞血瘀证、气阴两虚证、痰热阻肺证5种中医证型的MGMT启动子甲基化阳性率分别为85.00%、90.00%、15.00%、75.00%、20.00%，经样本间两两比较秩和检验，气滞血瘀证、痰热阻肺证两组与其他各组间均有显著差异（P＜0.01或P＜0.05）[5]。一项慢性萎缩性胃炎中医证型与胃粘膜cmycDNA甲基化水平研究发现，c-myc基因甲基化率在慢性萎缩性胃炎中医各证型间有显著性差异（P＜0.01），且各证型中c-myc基因甲基化率由高到低依次是胃热伤阴＞瘀毒内阻＞痰湿凝结＞脾胃虚寒＞气血双亏＞肝胃不和[6]。其他一些研究[7-12]的方法则类似。

同时，也可以对全基因组进行甲基化研究。一项基于全基因组甲基化的乙肝后肝硬化证候研究发现，HLA-DRB1和ADAMTS9，NUDT1和YES 1，APOA5和PRKCZ等基因的差异甲基化可能分别与湿热内蕴证、脾虚湿盛证和肝肾阴虚证的证候有关[13]。而且，在方法学上也有基于双生子进行研究[14]。另外，也有一些阴性结果的研究，如一项研究不同中医证型骨髓增生异常综合征RIZ1、ID4基因甲基化的结果[15]发现，RIZ1基因甲基化表达在不同中医证型患者中无明显差异。

2.3 中医干预机制相关研究

在分析证候甲基化差异的基础上，也有对甲基化相关酶以及中医药干预对甲基化影响的研究。一项中医抗衰老机理研究[16]发现，肾健脾方剂能明显提高生理性肾虚小鼠肝细胞DNA甲基化酶的活力，具有延缓衰老的作用。一项组蛋白去甲基化酶与肾虚型绝经后骨质疏松症的研究[17]发现，组蛋白去甲基化酶JMJD2A、JMJD2B表达程度，骨质疏松症患者组明显低于非骨质疏松症组。

另外一些中药干预研究发现，甲基化可能是一些中药干预的作用机制之一，如稳斑汤干预急性冠脉综合征痰瘀互结证血浆血栓调节蛋白基因启动子甲基化，治疗后较治疗前甲基化程度显著降低；对于乳腺癌高危人群根据中医辨证给予不同中药干预，结果发现血清TRβ1基因甲基化程度治疗后较治疗前明显降低；针对骨髓间充质干细胞给予补肾中药提取成分含药血清干预，结果发现含药血清组β-catenin基因甲基化状态较其他组有明显的降低，且组间差异有统计学意义（P＜0.05）[18-20]。

3 中医药领域DNA甲基化研究思路与优势

根据DNA甲基化调控机制的特点，结合中医学有待研究的科学问题，其相关的研究思路可从以下几点进行思考。其一，DNA甲基化调控是动态的，具有遗传性与可塑性；而中医的证候是动态演变的，而且受体质遗传因素的影响，又在与环境的相互作用下变化。试想，证候实质的生物学基础是否一定程度上反映在DNA甲基化这一层面？其二，DNA甲基化的调控方式在基因组中分布广泛，而中药的作用特点是针对关键调控节点发挥整体调节作用，其作用机制是否与DNA甲基化密切相关？其三，DNA甲基化作为经典的表观遗传学调控机制，其能否为中医证候的客观诊断与中药作用机制提供新的思路？具体可体现在从分子层面界定证候范围的生物标志物研究，以及从表观遗传学层面阐述中药作用机制、探讨方剂组分配伍原理的分子机制研究。

DNA甲基化的特点与中医学问题的相关性，决定了目前相关研究存在以下特色及优势：①中医证候处于动态变化过程中，受遗传与环境双重作用影响，而DNA甲基化既具有印记的遗传性，又受环境因素改变的可塑性，这就使得其在研究证候的时间特异性领域中占有了一定的地位，并为治疗提供了乐观的前景；②中医的主要思想就是整体观，而在脊椎动物中甲基化CpG在整个基因组中均有分布，这为研究中医药干预证候机制的整体性提供了依据；③中医利用中药干预人体的过程是复杂的，也不仅是多通路、多靶点的简单罗列，也许是复杂系统，而DNA甲基化调控基因表达存在影响转录因子的结合活性与甲基化结合蛋白抑制转录这直接和间接两种机制，为研究中医药针对不同环节治疗打开了思路[21-23]。

4 问题与展望

研发真正的分子靶向治疗药物的重要途径就是发现生物标志物，其中也包括中药单体药物的研发。而生物标志物需具备特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性高、取样无损害等特点，并对评估危险程度以及预测治疗效果有一定程度的临床指导价值。但目前只有很少一部分生物标志物真正用于临床，中医证候的生物标志物研究尚处于初级阶段，存在很多方法学的问题，也颇受争议。

用于中医证候诊断的生物标志物探索的难点在于：时间特异性、组织特异性以及正常参考值的确定。目前国际上较为成熟的生物标志物研究方法是利用Cox回归分析或随机森林分析方法，探索血瘀证高风险与低风险相关甲基化DNA/mRNA/microRNA/circRNA，训练组用于构建风险预测模型，测试组用于验证信度，并扩大样本量对模型进行验证和校正，以进一步提高模型的效能。但这种方法还不能完全满足中医学的研究，随着统计学家在动态模型构建方法上的突破，大数据时代思想与技术的逐步成熟，中医生物标志物模型的时空观特点也将逐步得以实现。

对于探索机制的调控网络研究，通过生物信息学分析构建网络仅仅是预测的结果，通过细胞和动物实验对生物标志物及上下游关系进行功能学验证则至关重要，比如运用5-Azacytidine（5-Aza）这种甲基化抑制剂培养细胞造成一系列梯度甲基化程度，同时检测目的基因转录水平，从而验证甲基化对该基因转录的调控作用[24]。但是值得注意的是，成熟的生物标志物也未必就是调控网络中的关键节点，而如果希望根据调控关键节点筛选中药有效成分或单体作为生物靶向药物，仍需以确定关键节点为前提。

综上所述，DNA甲基化本身的特点与中医的特色有着一种天然而隐约的联系，其研究思路也较为广泛且具有特色，但仍存在诸多问题。以下仅谈三点展望：

第一，现有研究表明，DNA甲基化的最终结果远远不止于控制基因表达，它扩展到基因组印记、X染色体失活，以及染色质结构修饰[25]。而基因印迹是一种基因是否表达由其来自父方或母方决定的现象，通过卵子和精子的形成过程中DNA甲基化精细微妙的变化而实现。实际上，基因印迹是对来自父方和母方遗传物质的一种选择，是在先天之精形成过程中适应性选择的机制之一，为先天之精作用后天的研究提供了思路，从而为诠释中医体质对疾病发生发展及证候演变的影响提供了研究基础[26]。

第二，DNA的甲基化不仅调控编码的mRNA的转录，同时也作为非编码RNA的调控机制之一。然而有趣的是，非编码RNA可以通过调节DNMT的表达而调节DNA的甲基化，所以非编码RNA——DNA甲基化两个层次的相互作用调节网络，可能是中医药干预作用的连锁放大效应以及反馈平衡机制之一，可能是中药作用的关键环节之一。

第三，利用高通量测序或芯片技术筛选差异甲基化位点及RNA水平差异（mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）后，对甲基化与RNA两个层面进行生物信息学分析，构建调控网络。其后，一方面根据差异倍数、统计学意义、基因功能注释结果，选择差异基因扩大样本量进行验证，构造生物标志物的证候诊断模型，可应用于人群的证候筛查、疾病证候分型、药物敏感性的预测；另一方面，对构建的调控网络进行药物干预相关网络的临床试验，以及动物和细胞的功能学验证，以进一步确立调控网络中的关键节点，从而从分子层面阐明中药作用机制，进而可应用于筛选中药有效成分、遴选中药单体等新药创制。

1Allis C D,JenuweinT,TrinbergD,et al.表观遗传学.北京:科学出版社,2009:36.

2Zhu J K.Active DNA Demethylation Mediated by DNA Glycosylases. Annu Rev Genet,2009,43(1):143-166.

3Bird A.The essentials of DNA methylation.Cell,1992,70(1):5-8.

4刘菲,徐瑞荣.急性髓系白血病中医证型与ID4基因启动子区甲基化相关性研究.中国中西医结合杂志,2012,32(4):471-473.

5李雪梅,许玥,林华胜,等.中晚期非小细胞肺癌MGMT基因甲基化表达与中医证型的相关性研究.四川中医,2012,30(5):36-38.

6刘庆生,桑怡,蔡丹莉,等.慢性萎缩性胃炎中医证型与胃黏膜cmycDNA甲基化水平差异研究.中华中医药学刊,2016,34(1):132-135.

7张清全.新疆伊犁地区维、汉人群变应性鼻炎患者IFN-γ基因甲基化及其中医证型的相关研究.乌鲁木齐:新疆医科大学硕士学位论文,2012.

8靖景艳.人急性髓系白血病中医辨证分型与RASSF1A、ZO-1基因甲基化的相关性研究.山东:山东中医药大学硕士学位论文,2013.

9黄定鹏.Runx3、Gst-π基因启动子甲基化与胃癌及中医辨证分型的相关性研究.广州:广州中医药大学硕士学位论文,2012.

10程荣菲,武哲丽.肝癌中医证型与DLC-1基因甲基化表达的相关性研究.四川中医,2015,33(2):64-67.

11唐梅森.基于DNA单核苷酸多态性和甲基化修饰探讨早发冠心病血瘀证的相关易感基因的研究.湖南:湖南中医药大学博士学位论文,2015.

12吴文婷.IL-17RC低甲基化影响葡萄膜炎的机制研究及中药治疗葡萄膜炎的临床体会.北京:北京中医药大学博士学位论文,2014.

13呼雪庆,苏式兵.基于全基因组甲基化的乙肝后肝硬化典型证候生物学基础观察.中华中医药杂志,2016,31(5):1868-1873.

14文钦.基于双生子研究证候差异的甲基化调控.成都:成都中医药大学硕士学位论文,2011.

15玄丽娜.不同中医证型骨髓增生异常综合征RIZ1、ID4基因甲基化异常表达及临床意义.山东:山东中医药大学硕士学位论文,2012.

16林一萍,陈比特,陈玉春.DNA甲基化酶与中医抗衰老机理的关系.中国中医药信息杂志,1999,6(6):18-19.

17唐宏宇.组蛋白去甲基化酶在肾虚型绝经后骨质疏松症的表达分析.广州:广州中医药大学硕士学位论文,2015.

18程修平,宫丽鸿,李楠,等.稳斑汤辅助治疗对急性冠状动脉综合征痰浊血瘀证患者血浆血栓调节蛋白基因启动子甲基化的影响.中医杂志,2016,57(2)：140-144.

19赵然,李国楼,张光强,等.中医辨证干预对乳腺癌高危人群血清TRβ1基因甲基化的影响.辽宁中医杂志,2015,42(9):1711-1713.

20潘乐.补肾药对BMSCs成骨与成脂分化及β-catenin、PPARγ甲基化的影响.陕西:陕西中医学院硕士学位论文,2014.

21米歇尔·沃尔德罗普.陈玲译.复杂.北京:生活·读书·新知三联书店,1998:147,162,320.

22钱学森,于景元,戴汝为.一个科学新领域——开放的复杂巨系统及其方法论.自然杂志,1991,13(1):3.

23戴汝为.复杂巨系统科学——一门21世纪的科学.自然杂志,1997, 19(4):190.

24 Lu X L,Wang L,Chang S Y,et al.Sonic Hedgehog Signaling Affected by Promoter Hypermethylation Induces Aberrant Gli2 Expression in Spina Bifida.Mol Neurobiol,201553(8):5413-24.

25[美]TollefsbolTO.表观遗传学实验手册.上海：上海科学技术出版社,2007:4.

26沈珝琲.染色质与表观遗传调控.北京:高等教育出版社,2006:135-136.

Application of DNAMethylation in Traditional Chinese Medicine

Chen Guang1,2,Wang Jie1
(1.Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China;2.Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

As a classic regulation method in epigenetics,DNA methylation regulates the process of transcription. Currently,it can be utilized in the field of biomarker discovery for traditional Chinese medicine(TCM)syndromes and the study of finding molecular targets of herbal medicine.The former is mainly about exploring the relationship between specific disease syndrome and specific DNA methylation,while the latter is related to evaluating the influence of TCM methods on the change of DNA methylation and relevant methylation enzyme.It is reported that the information of DNA methylation is inheritable and plastic and covers the whole genome,which makes it possible to study the spatio-temporal changes of TCM syndrome and holistic effects of TCM.However,the methodology of syndrome related biomarker discovery deserves improvement and the functional validation of the mechanism still needs further research.It is promising that DNA methylation may elucidate the influence of both inheritance and environment on the advance of diseases and syndromes,and that the interaction of DNA methylation and RNAs might lighten the mechanism of TCM and DNA methylation biomarkers would be employed for the syndrome screening in the population,differentiation of syndromes and prediction of effectiveness of particular medicine.

DNA methylation,traditional Chinese medicine,syndrome,mechanism

10.11842/wst.2017.06.011

R2-03

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：王晶）

2017-02-27

修回日期：2017-05-20

＊国家自然科学基金委面上项目（81473561）：冠心病血瘀证相关miRNA表达的甲基化调控机制研究，负责人：王阶；国家自然科学基金委面上项目（81673847）：冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA调控网络研究，负责人：王阶；科学技术部国家“重大新药创制”重大科技专项（2013ZX09301307）：宣痹安痛方药物研发，负责人：王阶。

＊＊通讯作者：王阶，本刊副主编，研究员，博士生导师，主要研究方向：中医药防治心血管病、血瘀证与活血化瘀研究、中医证候的规范化研究、中医药防治艾滋病。