鲍曼不动杆菌外膜蛋白的研究进展

李兴国，温汉春

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

鲍曼不动杆菌外膜蛋白的研究进展

李兴国，温汉春

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

鲍曼不动杆菌是一种重要的革兰阴性条件致病菌，近年来由于各种抗生素的广泛应用导致其形成了多重耐药菌和泛耐药菌。目前对于该菌外膜蛋白的研究相对较少。鲍曼不动杆菌相关的外膜蛋白，包括外膜蛋白A、外膜蛋白33-36、外膜蛋白W、外膜蛋白22、外膜蛋白AIS-1969等均为鲍曼不动杆菌致病毒力因子。外膜蛋白众多，且很多具有高度的保守性和免疫原性，研究这些外膜蛋白将会有利于人类找到合适的靶点构建疫苗，为人类的抗感染治疗增加新的手段。

鲍曼不动杆菌；外膜蛋白；细菌耐药性

鲍曼不动杆菌(AB)是一种需氧、不发酵，能够在不同环境中存活的条件致病菌。上个世纪90年代以前，AB对多数抗生素敏感且对人类无致病性。然而进入21世纪，人们发现AB可以引起多种院内感染性疾病如呼吸机相关性肺炎、菌血症、脑膜炎等。虽然很多学者对于AB流行病学、耐药机制等研究做了很大贡献，但对于其致病机制、表面蛋白及疫苗学的研究却相对较少。本文就AB外膜蛋白的研究进行以下综述。

1 膜蛋白A(OmpA)

OmpA是目前研究最为深入的AB致病毒力因子。该蛋白有多种功能，不仅可以促进菌体对宿主细胞的黏附、侵袭，诱导细胞凋亡，同时也可以刺激宿主的免疫反应。

1.1 OmpA的毒力效应 OmpA是一种低通透性孔蛋白。AB的OmpA属于多聚合孔蛋白家族中的单聚体外膜孔蛋白[1]，与大肠杆菌OmpA和铜绿假单胞菌的OmpF相似，具有转运小分子物质的功能。Lopes等[2]研究发现，AB的OmpA在细菌细胞膜表面所形成的孔道直径约为2 nm，仅为大肠杆菌OmpF的1/70，说明OmpA所形成的孔道非常微小，因此其通透性较低。虽然OmpA孔道微小，但当OmpA基因被敲除后，基因缺失菌膜通透性降低[2]。这一研究表明OmpA是AB表面非常重要的孔道蛋白。

OmpA在菌体黏附和侵袭宿主细胞过程中扮演重要的角色。Luo等[3]研究显示，OmpA不仅可以促进AB黏附于假丝酵母和人类肺上皮细胞(A549细胞)，同时也有助于AB侵入假丝酵母和肺上皮细胞体内，诱导其凋亡。研究者利用PCR技术测定了临床分离AB毒力因子OmpA的表达情况，发现临床菌株对A549细胞的黏附率与OmpA呈正相关关系[4]。这表明OmpA是AB重要的黏附相关因素。通过观察AB对A549细胞的黏附，发现其入侵上皮细胞是通过一种类似拉链的机制，这是一种微丝管依赖的摄取系统[5]。构建OmpA基因失活菌株，用该菌来感染A549细胞，发现基因失活菌株对细胞的黏附和侵袭均显著低于同源型野生菌株[6]。因此，可以推断AB在黏附和侵袭上皮细胞的过程中，OmpA起重要作用。OmpA可以引起线粒体分解，诱导宿主细胞凋亡。当AB野生菌株感染HEp-2细胞后可以观察到细胞线粒体分解、细胞凋亡[7]，但OmpA基因失活菌株感染HEp-2细胞后，细胞并没有凋亡。研究者制备了纯化的OmpA重组蛋白，并用该蛋白作用HEp-2细胞，发现重组蛋白定位于HEp-2细胞线粒体上，引发了大量的促凋亡因子如细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，激活了Caspase-3，进一步激活了Caspase-9，致使宿主细胞DNA降解[8]。这些说明OmpA可以进入宿主线粒体内并且启动细胞凋亡机制。

1.2 OmpA对机体的免疫反应 OmpA既可以上调宿主免疫分子的表达，也可以影响宿主的免疫反应。为了分析OmpA对固有免疫反应的影响，研究者利用人工重组OmpA作用于人源性HEp-2细胞，结果OmpA引起了一系列基因差异性表达，如提高了免疫反应的信号传导分子、Toll样受体2和诱导型一氧化氮合酶等的表达，但却并不能提高炎性因子和趋化因子的表达水平[9]。另有研究者使用OmpA侵染人树突状细胞(DC)，发现可以明显活化DC，促进DC高表达细胞表面分子CD40、CD54、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，同时诱导DC产生IL-12，增强DC的免疫反应能力[10]。Kunz 等[11]研究发现，OmpA刺激的DC可以激活CD4+T细胞，促进Th1极化相关细胞因子谱的表达。这些说明AB OmpA在刺激人类免疫系统反应的过程中发挥了重要作用。补体系统是人类固有免疫系统抵抗细菌感染的主要成分，而菌血症是AB引起的常见院内感染性疾病。Podnos等[12]研究显示，AB可以抵抗正常人血清补体系统介导的裂解作用。研究者通过基因突变技术构建了OmpA基因失活菌株，用人正常血清孵育该基因失活菌株一段时间后，该菌株多数被清除，而同源型野生菌株却生存良好。表明OmpA与菌体介导的抗补体作用有很大关联，这种关联可能是该蛋白直接参与抗补体作用或者是参与其他抗补体相关的机制，但具体机制仍需进一步研究。总之，OmpA是AB比较重要的逃逸补体杀伤的表面蛋白。

1.3 OmpA相关的疫苗研究 Luo等[13]研究发现，OmpA是一种比较保守的外膜蛋白，其菌种间氨基酸同源性≥89%，因此菌种间蛋白差异较小。与人类细胞表面蛋白对比发现两者同源性较低，通过不同的动物模型发现其免疫原性较好。此外通过蛋白质组学、二维电泳和质谱分析等技术发现，OmpA是AB外膜中含量最高的表面蛋白，因此可以考虑将其作为研制疫苗的候选抗原。Luo等应用纯化的重组OmpA和佐剂氢氧化铝通过静脉注射免疫糖尿病小鼠，2 d后发现小鼠体内产生了高水平的抗OmpA抗体。当免疫后的小鼠感染多耐药AB后其存活率明显高于对照组小鼠，其不同组织细菌载量也明显低于对照组。与此同时，研究者用抗OmpA抗体进行体外抗体活性实验，发现抗OmpA抗体不是直接加强血清中补体介导的固有免疫来杀灭菌体，而是通过抗体介导的调理吞噬作用来杀灭菌体。此外，另有研究者用纯化的AB OmpA作为抗原刺激小鼠鼻内黏膜，来诱导产生局部和全身黏膜抗体。经过一段时间刺激后，经OmpA免疫过的小鼠感染临床多重耐药AB后，其生存率明显高于同期对照组。这表明OmpA具有很好的免疫原性，可以经局部诱导进而产生全身获得性体液免疫。研究者检测了感染者和健康者血清，发现体内抗OmpA抗体为IgG抗体，且效价较高[14]。说明OmpA不仅具有很好的免疫原性，而且可以通过不同的途径诱导机体免疫。

2 外膜蛋白33-36(Omp33-36)

ABOmp33-36是一种典型的革兰阴性菌外膜孔蛋白，它与碳青霉烯类抗生素的耐药有关，在菌体中充当一种水通道蛋白[15]。Omp33-36可以随外膜囊泡一起被分泌到菌体外，作用于宿主细胞发挥其致病效应。Rumbo等[15]研究显示，Omp33-36可以诱导细胞凋亡。研究者用纯化的Omp33-36作用于HEp-2细胞，显微镜下发现HEp-2细胞皱缩、胞膜内陷、染色质固缩。研究者构建了Omp33-36基因失活的菌株感染吞噬细胞，发现基因失活菌株介导的细胞凋亡率明显低于同源型野生菌。此外在小鼠全身感染的模型中同样发现，基因失活组小鼠病死率明显低于同源型野生菌株。这表明Omp33-36是AB非常重要的一个毒力因子，其介导的细胞凋亡是其致病的主要机制。Omp33-36可以随外膜囊泡分泌至菌体外，因此可以考虑将其作为一个靶点，研究相应的特异性抗体或相应的药物阻止其与宿主细胞的作用，为抗感染治疗带来新的希望。

3 外膜蛋白W(OmpW)

OmpW是一个由183个氨基酸构成的疏水性孔蛋白，在已报道的AB中其同源性超过91%，且与铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的OmpW也具有很好的同源性[16]。OmpW不仅镶嵌于外膜，也存在于细胞质中，与细菌多种功能有关。通过构建重组OmpW可以发现其形成了小分子通道，该通道与铁离子的摄取有关，且属于铁调节子。当AB生长在铁离子丰富的环境中，铁载体不能表达，OmpW可以高表达并促进铁的摄取[17]。这表明，OmpW是维持铁离子在菌体内平衡的一种重要调节机制。既往研究表明，OmpW可以潜在地引起AB对替加环素和亚胺培南的耐药性。Huang等[16]研究发现，OmpW可以转运替加环素分子到外膜蛋白，但当OmpW缺失后并不能影响AB对替加环素和亚胺培南的敏感性。这说明OmpW可能参与了对替加环素和亚胺培南的耐药机制，但并不是决定性成分。

4 外膜蛋白22(Omp22)

Omp22由217个氨基酸构成，具有一个甘氨酸拉链和一个与OmpA蛋白C-端相似的肽段，且该肽段可以与肽聚糖结合。研究者用人肺上皮细胞A549和肿瘤细胞293FT检测Omp22的毒性，发现该蛋白并不黏附和侵袭宿主细胞，只在高浓度情况下抑制细胞的生长[18]。表明Omp22并不是细菌的毒力因子。Omp22经过折叠后具有免疫抗原表位，而且与人类蛋白质同源性极低，可以考虑将其作为疫苗候选抗原。研究者发现，经重组Omp22主动免疫的小鼠可以产生特异性高滴度的IgG抗体。随后经主动和被动免疫试验发现，经免疫后的小鼠其生存率增加、器官和外周血载菌量降低，血清中炎性细胞因子和趋化因子受到了抑制。这些研究表明，Omp22蛋白是一种新型值得开发的有效疫苗，可以通过其抗血清来控制AB的感染。

5 外膜蛋白AIS-1969(OmpAIS-1969)

AIS-1969是一种外膜蛋白，目前对其具体功能尚不清楚，但研究发现，其与BamA蛋白具有高度相似的三维结构。生物信息学分析表明，AIS-1969基因序列在AB中高度保守，因此研究者考虑将其作为疫苗研究的靶点[19]。研究者用纯化的可溶性AIS-1969α重组蛋白通过腹腔攻毒感染途径构建了动物主动和被动免疫模型，发现AIS-1969α免疫机体后可激发高效的保护性免疫应答，促进机体对AB的清除，抑制炎症因子的表达，抑制AB感染所引起的病理损伤。这说明OmpAIS-1969具有很好的抗原性，可以考虑作为疫苗研发的靶点，但对于其具体功能需要做深入的研究。

目前AB耐药率严重，已经对临床大部分药物耐药，因此研制新的治疗手段迫在眉睫。抗感染治疗史上，很多微生物通过疫苗免疫促使人类免于病患。AB外膜蛋白众多，且很多具有高度的保守性和免疫原性，因此，研究这些外膜蛋白将会有利于人类找到合适的靶点构建疫苗，为人类的抗感染治疗增加新的手段。

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