地中海贫血产前基因诊断技术的临床应用

秦丹卿 何天文 尹爱华

述 评

地中海贫血产前基因诊断技术的临床应用

秦丹卿1，2何天文1，2尹爱华1，2

地中海贫血是全球广为流行的遗传性溶血性疾病，是最常见的单基因遗传病之一。因缺乏理想的治疗手段，在高发地区通过对高风险夫妇进行产前基因诊断以避免重症地中海贫血患儿的出生，是国际上公认的首选预防措施。目前，临床广泛应用侵入性手术取得胎儿DNA并采用多种分子检测技术进行基因诊断，但有一定胎儿流产和宫内感染的风险。以胎儿游离DNA为检测标靶的无创产前诊断技术的迅速发展，为建立一种安全快速、简便准确的早期地中海贫血产前基因诊断方法带来可能。本文就目前应用于地中海贫血产前基因诊断的多种技术作一述评。

地中海贫血；产前基因诊断；分子检测；无创产前诊断

地中海贫血（地贫）是我国南方地区高发的遗传性血液病，由于其严重的致残、致死后果对家庭及社会带来的沉重负担，在包括我国南方在内的东南亚地区、地中海地区、印度、中东、北非等该病的高发地区，地贫已经成为这些地区的公共卫生问题。我中心此前对随机抽取的14 332个广东省户籍家庭的40 808个血样进行的大样本分子流行病学调查提示，广东省人口地贫基因致病突变携带率约为16.83%，相当于平均每6个人里就有一个携带地贫基因致病突变［1］。

因为缺少经济、有效的治疗手段，通过产前诊断避免重型地贫患儿的出生是目前国际上公认的首选预防措施［2-3］。地贫病因主要是由于珠蛋白基因发生缺陷导致相应的珠蛋白肽链合成减少或缺失，从而造成α和β珠蛋白肽链比例失衡而引起溶血性贫血［4］。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，主要可以分为α-地中海贫血（α-地贫）和β-地中海贫血（β-地贫）2类。地贫产前基因诊断的目的就是防止重型α-地贫又称Hb Bart's胎儿水肿综合征以及β珠蛋白基因突变纯合子或双重杂合子引起的重型β-地贫患儿的出生。进行产前基因诊断需要获得足量的胎儿DNA样本，目前临床上广泛应用的是侵入性（有创性）取材，根据不同孕周分别于11～14周行绒毛穿刺活检、16周之后行羊水穿刺或24周之后行脐带血穿刺。本文主要针对目前地贫产前基因诊断技术进行评述。

1 地中海贫血产前基因诊断技术

地贫基因诊断经过多年不断地研究，已有多种成熟的分子检测技术手段可应用于临床检测。目前临床上通过侵入性取材方式获得胎儿样本并进行DNA提取，应用多种基于PCR方法的分子检测技术对胎儿DNA进行α-或β-等珠蛋白基因突变的检测以明确胎儿的基因型，防止重型β-地贫患儿的出生、给予地贫高风险妊娠夫妇更多生下健康下一代的机会。

1.1 跨越断裂点聚合酶链反应（Gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR）

Gap-PCR是一种简便、快速、经济的检测基因大片段缺失的方法。其原理是：于缺失序列的两端设计一对引物，在正常序列中这对上下游引物间相距过远，以至超出有效扩增范围而不能生成扩增产物。大片段缺失的存在会使断端连接，上下游引物靠近，可以生成特定长度的扩增产物。PCR产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。Gap-PCR方法的优势是可以建立多重检测体系同时检测多种大片段缺失类型，在多种缺失类型的共同区域可以设计一对内对照引物以区分检测到的缺失类型是杂合子、纯合子或双重杂合子。我国南方地区应用这种多重Gap-PCR同时检测多种缺失型 α-地贫包括-α3.7/、-α4.2/、--SEA/、--THAI/等［5-6］，以及2种中国人群中常见的以高Hb F为表型的大片段β-珠蛋白基因簇缺失突变包括中国型Gγ（+Aγδβ）0缺失和东南亚型HPFH缺失［7-8］。但是此种方法仅限于断裂点已知的大片段缺失突变。

1.2 聚合酶链式反应-反向斑点杂交（polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB）

RDB技术是将待测突变位点的等位基因特异性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，ASO）探针（包括野生型和突变型）固定在杂交膜上，根据野生型探针还是突变型探针与PCR扩增靶序列DNA结合，以确定此样本中该位点是否突变以及确定是纯和还是杂合突变［9］。

该技术是当前临床所采用的常规检测方法，在临床实践中已应用20多年，可以在一个样本中同时检测多种突变类型，结果可靠、准确性高。在我国南方常用于检测南方人群常见的β-珠蛋白基因17种点突变类型以及α-珠蛋白基因3种点突变类型［10］。缺点是杂交操作过程繁复，耗时长，大批量检测时保证检测质量有难度。

1.3 多重连接依赖性探针扩增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）

当怀疑样本可能存在罕见大片段缺失突变，而缺失序列的断裂点未知，不能应用Gap-PCR方法检测时，可以应用MLPA技术。MLPA技术是设计多组专一的与目的序列互补的探针组，探针组范围覆盖整个目的序列。此技术的关键点是只有每对探针与目的序列完全互补杂交时，此对探针才可在连接酶作用下连接成为一条完整的核酸单链，之后再以连接完好的探针而不是目的序列为模板进行PCR扩增［11］。因每组探针长度不同，故其扩增产物片段长度也不同，PCR扩增产物通过毛细管电泳进行分离，通过相关软件分析目的序列与正常对照序列的产物峰高，并计算比值。

MLPA技术是单管一次性的进行连接和PCR反应，可以一次完成50个核苷酸序列的检测。该方法可以对α、β珠蛋白基因簇进行相对定量分析，虽然不能判断确切的缺失类型，但能准确反映整个α、β珠蛋白基因簇及其上下游调控序列的重复、缺失突变，以及α、β珠基因拷贝数的变化。此方法技术平台建立要求略高，需自动测序仪进行片段分析，并且对DNA质量要求较高。近年来，多篇文献报道应用此技术确诊了多例罕见α或β珠蛋白基因簇的缺失、重复或重排等突变类型的病例［12-14］，此技术作为传统基因诊断技术的补充，可以提高产前基因诊断的准确率。

1.4 珠蛋白基因测序（globin gene sequencing）

对于临床表型和筛查结果提示疑为地贫基因突变携带者而已经排除常见突变类型的样本，提示此样本可能存在罕见基因突变类型或尚未发现的新发突变类型，可以考虑对α-或β-珠蛋白基因进行测序分析。目前临床基因测序诊断主要是Sanger双脱氧链终止法。对PCR产物进行测序除可检测到常见类型的点突变外，还可检测出不常见或者罕见类型的点突变、微缺失或者插入突变。当血红蛋白电泳分析提示有异常血红蛋白区带时，也可通过此方法进行异常血红蛋白的基因型精确诊断。珠蛋白基因测序既可以确定突变位点又可以确定突变类型，是突变验证、确认以及新基因突变鉴定的金标准。但此技术仪器成本昂贵，操作步骤繁琐，需专业人员判读结果，这些不足极大地限制了其在临床诊断中的大范围应用。

1.5 扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）

点突变类型的检测除了可以采用RDB等方法外，也可以采用ARMS法，也称为等位基因特异性PCR（allele specific PCR，AS-PCR）。这是一种通过设计3’-端碱基特异性引物来检测DNA序列已知点突变的方法。针对已知突变，同时设计野生和突变序列的2条引物，它们分别与一条共同引物配对。这2条引物的3’-端碱基是分别与野生和突变序列特异性互补，因PCR对引物3’-端与模板的互补性要求较高，所以野生序列引物与野生序列模板互补，突变序列引物与突变序列模板互补［15］。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析。若只有野生引物扩增，则提示无相应突变；若野生和突变引物均扩增，则提示为突变杂合子；若只有突变引物扩增，则提示为突变纯合子。

此技术因快速简便、经济等优点，已在一些国家或地区在多种遗传病及多态分析中推广应用［16-17］。其缺点是不能一次性同时检测过多突变位点，所以仍不能代替RDB方法在临床α-或β-珠蛋白基因点突变类型的检测。

1.6 高分辨率熔解曲线（high-resolution melting analysis，HRMA）

HRMA技术是近年来兴起的一种用于突变筛查和基因分型的新型遗传学分析技术。该技术是在实时荧光PCR反应前将饱和荧光染料加入反应体系中，PCR反应结束后产物直接运行高分辨率熔解，根据荧光信号变化绘制出不同形状的温度熔解曲线，以此区分不同基因型［18］。HRMA技术高特异性、高灵敏度、高通量、高重复性和低成本的特点，使该技术已广泛用于基因分析、突变筛查、人类白细胞抗原（human leukocyte antige，HLA）配型以及甲基化分析等。

近年来国内外多项研究将HRMA技术应用于β-地贫的基因诊断及产前基因诊断［19-21］，与传统的RDB方法相比较，HRMA技术具有操作简便快捷大大缩短产前诊断时间、真正的闭管操作避免污染以及结果判读简易等突出优势［21］。

1.7 液相芯片技术（suspension array）

液相芯片技术也称悬浮阵列技术（suspension array），本中心自主发明设计了一种基于液相芯片系统诊断地贫的试剂盒并已应用于临床［22］。此发明针对常见的23种α-和β-珠蛋白基因突变类型设计探针并分别与不同颜色的荧光编码微球交联混合后，制备成用于检测的液相芯片系统。将利用特异性引物扩增后得到的PCR产物与液相芯片进行杂交，用藻红蛋白进行荧光标记，通过液相芯片检测仪读取结果。此技术极大地缩短了地贫的检测时间，具有高通量、自动化、高灵敏度和灵活等特点，尤其适用于大样本量的实验室检测。

1.8 母体细胞污染（maternal cell contamination，MCC）分析技术

应用分子检测技术手段对侵入性取材获得的胎儿标本进行检测时，因取材过程中可能附带的母亲外周血或蜕膜组织等会造成不同程度的MCC，对产前基因诊断的结果有误诊的风险。随着高敏感性PCR扩增技术的发展和应用，微量的MCC即可导致假阳性或假阴性结果而造成误诊。因此，常规建议对进行单基因遗传病基因诊断的同一份胎儿样本要进行MCC分析，并且母亲标本（一般为外周血）需平行分析以确保检测结果的准确性［23］。

在选择MCC检测方法时，可以通过混合母体和胎儿DNA建立多种浓度MCC梯度模型。原则上建议所选用的MCC分析方法可以检测到最低10%浓度MCC［24］。目前，临床主要检测MCC的方法是选取人类不同染色体上的多个短串联重复序列（short tandem repeats，STR），对这些多态位点进行荧光定量PCR（quantitative fluorescent PCR，QFPCR）扩增，PCR产物通过毛细管电泳分离，此方法可以检测到最低5%MCC［25］。理想的MCC分析方法对于产前基因诊断方法应该具有相等或者更高的敏感性，在地贫的产前基因诊断中，常规的RDB技术敏感性高于QF-PCR技术，当RDB结果提示某些胎儿样本有极微量MCC而QF-PCR结果未提示时，这种情况下建议更换另外的基因诊断方法以确认基因型结果［23］。针对这个问题，本中心最近的一项研究［26］通过建立MCC程度梯度模型，初步建立了微滴式数字PCR（droplet digital PCR，DD-PCR）技术鉴定产前诊断样本MCC的方法。研究结果显示，在反应条件一致的情况下，DD-PCR技术可检测到低至1.562 5%的MCC，而QF-PCR可检测到最低6.25%MCC，说明与传统技术比较，检测极微量MCC样本，DD-PCR技术具有更高的敏感性。此外，因MLPA技术可对靶序列的扩增产物进行相对定量分析，因此在一定程度上可以甄别微量外源污染。陈亚军等［27］利用MLPA检测出样本的α1和α2基因的相对定量值判断出拷贝数，可以解决一些GAP-PCR法检测结果矛盾或无法确诊的病例确诊基因型。说明GAP-PCR法联合α-珠蛋白基因MLPA法检测α-地贫基因缺失，在一定程度上可以有效排除产前诊断胎儿标本的外源或母源污染影响，防止误诊。

2 展望

除母体细胞污染导致的基因型误诊风险，侵入性手术取材方式还有一定的流产和宫内感染风险，所以寻找安全、无创、准确、简便的早期基因诊断方法一直是地贫产前基因诊断的热门研究方向。近年，通过分离孕妇外周血浆中胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）而实现的NIPT成为国内外研究的热点领域，为地贫的无创产前诊断提供了新的思路。该技术已在检测性别决定基因（sex-detemining region Y，SRY）以排除X连锁遗传病、RH血型分析和染色体非整倍体的诊断等领域被广泛应用［28］。目前，NIPT在地贫产前诊断的研究方向主要包括排除性诊断和确定性诊断。

2.1 排除性诊断

排除性诊断都是通过检测父源性突变位点，如父母双方携带不同突变，则通过父源性突变位点阴性结果就可以排除胎儿纯合子的可能，其基因型只有母源性突变位点杂合子或野生纯合子2种可能。此种方法诊断相对简单，Chiu等［29］和Li等［30］报道的β-地贫无创产前基因诊断采用了此种方法。如父母双方携带同型突变，则需要借助区分父母的与致病突变连锁的STR/SNP位点，以此排除父源性突变［31］。利用东南亚型α-地贫（--SEA/）缺失范围内STR或SNPs位点排除父源性水肿胎的多个研究证实了此种方法诊断率受STR或SNPs位点位置和数量的影响较大［32-33］。Chan等［34］也将这种方法应用于中国南方人群β-地贫的产前诊断。但这类研究方向需要建立一组与致病突变连锁的有诊断价值的SNPs数据库，且未对母源性突变位点进行分析，所以临床应用受到很大限制。

2.2 确定性诊断

确定性诊断指的是基于SNP位点或单体型的相对含量计算。应用数字PCR（digital PCR，DPCR）技术对母体血浆总游离DNA进行含SNP位点目的序列的定量扩增，再应用相对突变剂量（relative mutation dosage，RMD）方 法 进 行 分析［35］。此方法尤其适用于父母双方携带同型突变的常染色体隐性遗传病，在β-地贫的无创产前基因诊断方面也有相关研究报道［36］。随着二代测序技术的发展，采用二代测序技术进行全基因组水平的高通量测序，可以一次性完成所需序列信息的采集，然后用相对单体型剂量（relative haplotype dosage，RHDO）分析法对孕妇血浆中单体型的相对含量进行计算［36］。这些后续研究极大地推动了NIPT在地贫产前基因诊断方面的应用。但二代测序技术成本昂贵、cffDNA含量较低导致扩增效率低、数据分析方法复杂等问题使NIPT在地贫产前诊断方面还无法付诸临床实践。

理想的产前诊断方法需要诊断精确，保证母胎安全以及具备广泛的应用性。目前地贫产前基因诊断仍然要依赖基于侵入性取材的基因技术手段进行检测。因地贫基因突变类型的多样性和复杂性，在保证排除母体细胞污染的前提下，应该采用多种检测方法相辅相成，以确保诊断的精确性。无创产前诊断的安全性和早期诊断的特点，使其成为地贫产前诊断未来的重要发展方向。随着技术的不断创新和完善，希望地贫无创产前基因诊断能尽早地应用于临床。

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The clinical applications of prenatal genetic diagnosis for thalassemia

QIN Danqing1，2，HE Tianwen1，2，YIN Aihua1，2
（1.Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511442； 2.Maternal and Children Metabolic-Genetic Key Laboratory of Guangdong， Guangzhou，Guangdong，China，511442）

Thalassemia is one of the most common monogenic inherited diseases,with the highest prevalence in the world.Due to the lack of an ideal treatment,currently the first-choice method is the prevention of births of children with severe cases as detected by prenatal genetic diagnosis for high-risk couples in high-prevalence areas.Currently,the widely used invasive operation used to obtain fetal genetic material for genetic diagnosis has the risk of miscarriage or intrauterine infection.Since the cell-free fetal DNA-based noninvasive prenatal diagnosis technology has been rapidly developed,it is likely to establish a safe,rapid,simple and accurate method for early prenatal diagnosis of thalassemia in future.In this review,the applications of the molecular tests currently used for prenatal genetic diagnosis of thalassemia are briefly reviewed.

Thalassemia;Prenatal genetic diagnosis;Molecular test;Non-invasive prenatal diagnosis

国家重点研发计划项目（2016YFC1000703）

1.广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东，广州511442

2.广东省妇幼代谢与遗传病医学重点实验室，广东，广州511442

尹爱华，E-mail：yinaiwa@126.com