MiRNA-3p/5p在肿瘤中的研究进展

张凌宇 陈昌杰 杨清玲

MiRNA-3p/5p在肿瘤中的研究进展

张凌宇1陈昌杰2杨清玲2

Pre-miRNA经Dicer酶剪切产生2个产物，分别是miRNA-3p和miRNA-5p，以往的研究多数都是以单一的miRNA-3p或者miRNA-5p为主，而miRNA-3p/5p成对调控肿瘤的发生发展却少有报道。本文就近年来miRNA-3p/5p与肿瘤的研究进展做一综述。

miRNA-3p；miRNA-5p；肿瘤；作用机制

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类短的单链内源性非编码RNA，可与靶mRNA的3'非编码区部分序列不完全或完全互补配对，引起靶向mRNA的翻译抑制或特异性降解，调控基因表达，从而调节细胞增殖、分化，凋亡等生命过程。前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）具有典型的茎环结构，靠近5'端茎部的miRNA加工成熟即为miRNA-5p，从3'端茎部加工成熟即为miRNA-3p，而两者之中表达丰度较低的通常被命名为miRNA*，其稳定性较差，容易被Dicer酶降解。因此，以往的研究多数都是以单一的3p或者5p作为研究对象［1-6］，所以很少有文献提及miRNA的2个臂同时参与细胞活动的相关功能事件，而近年来越来越多的研究表明miRNA的3p、5p 2个臂都可以参与调控生物体的相关功能［3，7-8］，丰富了miRNA参与的调控网络。

1 miRNAs概述

miRNA是一类具有调控功能的内源性非编码小分子单链RNA，其长度约17～25个核苷酸，广泛表达于动物、植物等真核细胞生物内。miRNA通过缺失、过表达、基因沉默、突变、作用于不同转录因子等多样的机制在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。

2 miRNAs的成熟过程和命名规则

2.1 miRNAs的生物合成过程

成熟的miRNA的生成首先是通过细胞核内的RNA聚合酶II（RNA ploymerase II）或者RNA聚合酶 III（RNA ploymerase III）生成初始 miRNA（primiRNA），Pri-miRNA会在核内切酶Drosha Rnase III的作用下，剪切去3′端多聚腺苷尾结构和5′端7-甲基鸟苷帽式结构，形成只含有发夹结构的premiRNA，pre-miRNA从核内转运到胞质中，经过Dicer酶降解形成成熟的 miRNA［9-11］，Pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切形成22个核苷酸左右长度的双链RNA，该双链RNA是由成熟的miRNA和与其碱基不完全互补的miRNA*组成的二聚体结构，最后在RNA解螺旋酶的作用下，形成成熟的miRNA和miRNA*［12］。在哺乳动物和果蝇中，Dicer酶会分别从3′和5′端与pre-miRNA结合。根据 3′数量法则，Dicer酶会从 3′端的第 21～25 个核苷酸进行剪切，形成miRNA-3p，而根据5′数量法则，Dicer酶从5′端第22个核苷酸位置进行剪切，形成 22 bp 的 miRNA-5p［13］。这是经典的 miRNA生物合成途径。此外，Ruby等［14］发现了一种不同于经典miRNA合成途径的Mirtron途径，该途径不依赖于Drosha酶剪切生成miRNA前体（pre-miRNA），该途径的发现为进一步解释miRNA的产生机制提供了重要资料以及新的研究思路。

2.2 miRNAs的命名规则

miRNA的命名一般按照如下规则：①早期研究发现的miRNA，如lin-4和let-7等，仍然保留原来名字不变。②miRNA的成熟体简写成miR，其前体则用mir表示，再按照其物种名称，以及被发现的先后顺序，例如mmu代表小鼠，hsa代表人，rno代表大鼠，如hsa-miR-155和mmu-miR-155。③高度同源的miRNA在数字后加上英文小写字母（a、b、c……），如 hsa-miR-125a、hsa-miR-125b。④通常一个pre-miRNA长度约为70～80 nt，很可能双臂会都会产生miRNA。这种情况以前的做法是在表达丰度比较低的miRNA后面加上*号，而表达丰度较高的miRNA后面不添加任何符号。以往的研究认为 miRNA*是没有功能的［1，3-5］，但是最近有文章报道这些miRNA*其实是有功能的，甚至在某些组织里miRNA*的表达量高于miRNA［6，8，15-16］。因此取消了以前的命名模式，如今的命名规则是：如果一个miRNA前体的双臂都能产生 miRNA，则以“-5p”和“-3p”分别命名，分别表示从前体的5′端臂和3′端臂加工而来，如hsa-miR-155-3p和has-miR-155-5p。⑤由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以区别，如hsamiR-521-1 和 hsa-miR-521-2［3］。

3 miRNA＊的研究新进展

miRNA*是在miRNA成熟过程中产生的与其不完全互补的大约22个核苷酸长度单链RNA。由于在细胞中，大多数miRNA*的表达丰度远低于其相应的miRNA，并且有实验证明，在miRNA与AGO1蛋白形成RISC复合体（RNA诱导的沉默复合体）后，与之相对应的miRNA*则不会形成RISC复合体，容易被相关的酶降解［13，17-18］。因此，miRNA*都被认为是在miRNA合成过程中产生的没有作用的产物［1，19］。而也有一些实验证明，miRNA*与miRNA相比较而言，其3′端和5′端的保守性都不及 miRNA［2-3］。此外，与 miRNA 的 3′端相比，miRNA*的5′端稳定性更好，这种热动力学上的不对称性，使得miRNA更容易被选中参与形成RISC，与之互补的 miRNA*则被降解［4-5，20-21］。因此，在以往的许多研究中，都认为miRNA*是没有作用的［1-6］。随着miRNA研究的深入，越来越多的研究发现，miRNA*可以和miRNA一样，参与基因转录后的调控网络［6，8，15-16，22-24］。而最近的研究表明，在某些生物特定的组织中，miRNA*的表达丰度并不比miRNA低，甚至远高于miRNA的表达丰度［7，25］。miRNAs的序列是高度保守的，而大部分的miRNA*s的序列也是高度保守的，有时候，miRNA和与其相对应的miRNA*在同一组织中高表达，如hsa-miR-590-5p和hsa-miR-590-3p（hsa-miR-590*）在肝癌 HepG2、Hep3B、Huh7 3株细胞系中高表达，都具有促进肿瘤发生的生物学功能［22］。有的miRNA和其miRNA*在同一组织中低表达，如 hsa-miR-139-5p和 hsa-miR-139-3p（hsa-miR-139*）在膀胱癌组织中表达下降，下调了hsa-miR-139-5p和hsa-miR-139-3p后，可以明显促进膀胱癌细胞的增殖迁移能力，而上调了hsa-miR-139-5p和hsa-miR-139-3p以后可以抑制膀胱癌细胞的增殖迁移能力［6］。有的miRNA与其miRNA*在同一物

种不同的组织中分别高表达，比如在小鼠中，miR-142-3p在胚胎和新生胎儿中高表达，而其互补的miR-142-5p却在卵巢、睾丸和脑等组织高表达［26］。有些miRNA与其miRNA*在同一肿瘤中都发挥着抑癌或者原癌基因的作用［3，6-8，22，26］，而有些miRNA与其miRNA*在同一肿瘤中作用则相反，比如在人结肠癌细胞系中，hsa-miR-28-5p的过度表达可以抑制结肠癌细胞的增殖迁移和体外侵袭能力，而hsa-miR-28-3p表达增加可以促进结肠癌细胞增殖迁移和体外侵袭［27］。此外，miR-96-5p在肝硬化、发育不良结节发展为肝癌的过程中表达量逐渐上调，而miR-96-3p在此过程中表达量却是逐渐下调的［28］。

4 miRNA与miRNA＊的作用方式

随着对miRNA*s研究的深入，对miRNA*在生物体内的作用机制也逐渐清晰，miRNA与miRNA*的作用方式极为相似，都可以特异性切割靶基因或者在mRNA水平抑制靶基因翻译过程［15，29］。因此，miRNA*和 miRNA 一样，在真核生物基因表达过程中作为一类负性调控因子，参与生命个体的成长发育、机体代谢、疾病发生发展的诸多重要过程。由于miRNA和miRNA*在序列上互补，它们作用的靶基可能相同也有可能不完全相同，有一小部分研究显示，如miR199a-3p/5p、miR-297b-3p/5p靶向同样的mRNA，在同样的病理生理过程中发挥相同的作用［23-24］。因此，在生物体的调节过程极中，miRNA与其miRNA*可能发挥着相同或者不同的功能［6，16，30］。近年来有新研究表明，miRNA和其miRNA*可以通过两者浓度的比值的改变来发挥功能。Kuchenbauer等人［31］在研究miR-223对骨髓祖细胞的调节作用时发现，miR-233与miR-223*都具有抑制活性，两者均靶向胰岛素样生长因子1受体/磷脂酰肌醇3-激酶轴，并且高水平的miR-223*与急性髓系白血病的总生存率呈正相关。进一步研究发现miR-233与miR-223*还可以通过两者比值的变化参与骨髓细胞的分化。

5 miRNA-3p/5p与肿瘤

5.1 miR-590-5p/3p与肝癌

YANG等人［22］利用miRNA芯片以及qRTPCR技术，对肝癌标本以及各细胞株HepG2、Hep3B、Huh7、L-O2（正常肝细胞株）进行分析，qRT-PCR验证了临床肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织相对于癌旁组织，miR-590-3p、miR-590-5p表达均同步上调，qRT-PCR结果进一步发现，HepG2、Hep3B、Huh7 3株HCC细胞株相比于正常肝细胞株L-O2，miR-590-3p、miR-590-5p同样表达上调。通过双荧光素酶和Western Blot验证，miR-590-3p和miR-590-5p分别直接靶向PTEN（第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因）和程序性细胞死亡因子（programmed cell death 4，PDCD4），从而激活PI3K-AKT信号通路，促进AKT1-S473的磷酸化水平，具有促进HCC的发生。由此可见，miR-590的2个臂的miRNA在HCC恶变中发挥着至关重要的作用，而2个臂同时发挥类似协同的生物学功能，在以往的报道中是很少见的。

5.2 miR-582-3p/5p与膀胱癌

Keita 等人［32］分析 UM-UC-3、5637、J82、TCCSUP、T24、HT1376和RT4多株膀胱癌细胞株以及来自29例临床膀胱癌患者的53例癌组织与28例与之相匹配的癌旁组织，通过qRT-PCR法检测，结果发现miR-582-3p/5p在膀胱癌细胞系以及在膀胱癌组织中表达强烈下降，通过分别对miR-582-3p和miR-582-5p过表达可以显著降低膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力，而通过动物模型尿道注射合成的miR-582-3p/5p类似物以后，肿瘤的生长被显著抑制，进一步的研究发现，PGGT1B、LRRK2、DIXDC1同时作为miR-582-3p/5p共同的靶基因，使用siRNA技术敲除这些基因以后，与过表达miR-582-3p/5p得到了相同的结果［32］。由此可见，miR-582-3p/5p之间相互的协同作用，在膀胱癌的发展过程中发挥着重要作用，也为膀胱癌的临床治疗提供了新的治疗方案。

5.3 miR-96-3p/5p与肝癌

Zhang等人［23］对28例肝硬化发育不良结节、34例分化良好的肝细胞癌组织、16例晚期肝癌以及对应的肝硬化组织进行实时荧光定量发现，miR-96-5p从肝硬化到发育不良结节再到HCC的过程中显着上调，HCC中miR-96-5p的中位表达水平比高级别发育不良结节（high-grade dysplastic nodule，HGDN）高2.83倍，而在分化良好HCC和晚期HCC之间miR-96-5p的表达没有显着差异。相反的，miR-96-3p在肝硬化到发育不良结节的过程中，表达量逐步降低，而在HCC中则完全不可检出。进一步的研究发现［23］，miR-96-5p表达对HCC检测的灵敏度和特异性分别为47.1%和79%，因此miR-96-5p的在诊断HCC方面价值有限。然而，miR-96-3p阴性表达对于HCC检测的敏感性和特异性为88.2%和84.2%，表明miR-96-3p表达水平是HGDN和HCC鉴别诊断的良好标志物。而当与GPC3免疫染色结合时，用于HCC检测的灵敏度和特异性分别为67.7%和100%。对miR-96的研究，在HCC的诊断方面提供了进一步的帮助。

5.4 miR-409-3p/5p与前列腺癌

Sajni等人［24］在研究前列腺癌的过程中发现，前列腺癌较良性前列腺增生组织相比，miR-409-3p与miR-409-5p表达量上升，在具有高Gleason评分的前列腺癌患者的肿瘤组织中，相对于较低Gleason评分，miR-409-3p和miR-409-5p都升高。进一步通过小鼠前列腺癌模型也发现，过表达miR-409-3p/5p可以诱导肿瘤的生长，而且在使用miR-409-5p抑制剂以后可以明显减少前列腺癌的骨髓转移，通过研究证实，miR-409-3p/5p可以靶向抑制共同靶基因RSU1，以前的研究表明，在前列腺癌中RSU1蛋白可以阻断致癌性的Ras/MAPK途径和整合素连接激酶（integrin-linked kinase，ILK）途径［33-35］。而miR-409-5p可以靶向STAG2和NPRL2，降低两者在前列腺癌组织中的表达。因此，miR-409-3p/5p在前列腺癌组织中的过度表达，以及在小鼠正常前列腺上皮中显示出的致瘤性以及促进前列腺癌骨转移方面，使得miR-409成为一个新的癌症检测的生物标志物，为肿瘤的治疗提供了新的研究方向。

6 小结及展望

综上所述，随着miRNA作用机理的深入研究，以及高通量技术如miRNA芯片的技术创新，miRNA*同miRNA一样可以参与真核基因表达的负调控，具有调控生长发育分化以及疾病发生发展的能力，从进化的角度看，miRNA*不可能仅仅是miRNA加工过程中产生的无作用的副产品，本着生物体节约的原则，miRNA*可能有着特殊的使命。这丰富了miRNAs的种类，拓宽了miRNAs参与的基因调控网络。尤其miRNA-3p/5p在肿瘤中的差异化表达，对于全面理解复杂精细的基因调控网络提供新的帮助。

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MiRNA-3p/5p in tumor development

ZHANG Lingyu1,CHEN Changjie2,YANG Qingling2
（1.Clinical Testing and Diagnose Experimental Center,Bengbu Medical College,Bengbu，Anhui,China,233000;2.Department of Biochemistry&Molecular Biology,Bengbu Medical College,Bengbu，Anhui,China,233000）

Pre-miRNA by the Dicer enzyme cuts produced 2 products,miRNA-3p and miRNA-5p,respectively,most of previous studies are dominated by a single miRNA-3p or miRNA-5p,and miRNA-3p/5p into the regulation of tumor development in pairs is rarely reported.In this paper，recent development of miRNA-3p/5p and cancer will be summarized.

MiRNA-3p；MiRNA-5p；Cancer；Mechanism

安徽省教育厅自然科学重大项目（NO：KJ2015ZD29，KJ2016SD37）；安徽省自然科学基金（NO：1508085MH159）；安徽省高校学科（专业）拔尖人才学术资助重点项目（NO：gxbjZD2016069）；安徽省蚌埠市科技计划项目（NO：20150309）；蚌埠医学院研究生创新计划（NO：Byycx1615）

1.蚌埠医学院临床检验与诊断实验中心，安徽，蚌埠233000

2.蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室，安徽，蚌埠233000

杨清泠，E-mail：yqlmimi@163.com