食管鳞癌循环肿瘤细胞检测方法研究进展

韩露，崔凯，王振丹，李胜

(1济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250022；2山东大学附属山东省肿瘤医院 山东省医学科学院)

·综述·

食管鳞癌循环肿瘤细胞检测方法研究进展

韩露1,2，崔凯2，王振丹2，李胜1,2

(1济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250022；2山东大学附属山东省肿瘤医院 山东省医学科学院)

食管鳞癌是临床常见的恶性肿瘤之一，60%～80%食管鳞癌患者在接受根治性手术后出现复发或远处转移。肿瘤细胞播散入血并形成转移灶被认为是导致食管鳞癌患者预后较差的重要原因之一。循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或因诊疗操作导致肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞。研究发现，CTCs在食管鳞癌的复发和转移过程中发挥了重要作用。目前,已报道的CTCs检测技术有50余种，各种方法优缺点各不相同，其临床适用情况也不尽相同。本文主要就食管鳞癌CTCs检测方法的研究进展作一综述。

食管鳞癌；循环肿瘤细胞；检测技术；预后

食管鳞癌早期症状隐匿，恶性程度高，患者就诊时多属中晚期，故患者预后较差，5年生存率为15%～25%[1～3]，复发和转移是患者预后较差的主要原因。临床上有相当一部分患者，就诊时肿瘤分期较低，治疗前也无明显转移证据，在行肿瘤根治术后却早期死于肿瘤复发和远处转移，说明存在用常规临床检验和组织病理学方法不能检出的癌细胞播散或隐性转移[4]。循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或因诊疗操作导致肿瘤原发灶或转移灶脱落进入外周血循环的肿瘤细胞[5]。近年来随着现代生物技术的发展，CTCs检测日益引起临床重视。CTCs检测主要包括富集和鉴定两个步骤。CTCs富集技术主要有基于细胞形态的密度梯度离心法、膜过滤分离法(ISET法)和免疫磁性富集方法(如Celltracks®AutoPrep®系统、免疫磁珠负性筛选策略等)[6～8]；鉴定技术包括免疫学技术、RT-PCR技术、酶联免疫斑点技术和CTCs芯片技术等[9～11]；检测方法众多，但各具特征[12]。本文结合文献就食管鳞癌CTCs的检测方法研究进展作一综述。

1 CTCs 的特点、分类及作用

CTCs是指存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称。肿瘤组织每天会释放大量肿瘤细胞入血，但这些肿瘤细胞在循环系统中的存活率极低，一般每1×108个正常血细胞中仅含有1个[13]；Yu等[14]研究发现，乳腺癌CTCs的上皮和间叶成分呈现动态改变，并根据上皮(E)和间质(M)组织标志物的比例将CTCs分为E、E>M、E=M、E

2 食管鳞癌CTCs的主要检测方法及其临床评价

2.1 检测方法 目前，食管鳞癌CTCs的检测方法、研究数据远远落后于其他类型恶性肿瘤。其主要检测方法有RT-PCR技术、免疫磁珠负性筛策略、Celltracks®AutoPrep®系统和ISET法4种。

2.1.1 RT-PCR技术 RT-PCR技术是将肿瘤特异性mRNA序列逆转录为cDNA，通过PCR扩增来识别肿瘤特异性mRNA的表达。这些特异性mRNA通常在正常外周血中不表达，因原发灶肿瘤细胞分泌的mRNA进入血液后被降解，但据此可推测检测到的mRNA来自CTCs的表达。Cao等[18]以Survivin mRNA为检测标志物，用RT-PCR技术检测外周血中CTCs，结果发现Survivin mRNA的检出率为47.2%，Survivin mRNA表达与肿瘤浸润、血管侵犯、淋巴结转移和临床分期等明显相关；随访发现，Survivin mRNA阳性者比阴性者复发率更高，生存期更短。表明RT-PCR技术检测外周血CTCs的效能较好。RT-PCR技术能从(1～10)×106个正常细胞中检测出1个肿瘤细胞，敏感性较高，是检测肿瘤隐匿性微转移的有效方法。但目前食管鳞癌CTCs检测尚缺少统一的检测标志物。此外，该方法需要破坏肿瘤细胞，无法对CTCs进行计数、形态学观察及下游分析，限制了其在CTCs检测中的应用。

2.1.2 免疫磁珠负性筛选策略 免疫磁珠是由John Ugelstar等于1979年首先制备出，该方法首先用红细胞裂解液去除红细胞，将标记抗CD45的Miltineyi纳米磁珠与白细胞结合，通过强磁场时去除白细胞，富集到外周血稀有细胞；然后用免疫荧光方法检测出抗上皮标志CK8/18/19阳性、抗白细胞标志CD45阴性和细胞核DAPI染色阳性的细胞，然后结合细胞大小、细胞核大小和形态等鉴定出CTCs[19]。任传利等[20]将免疫磁珠负性筛选策略与原位杂交技术结合，检测了11例食管鳞癌患者外周血CTCs，并对CTCs的8/20号染色体进行荧光原位杂交分析；结果发现，CTCs的检出率为43.8%，其中80%的CTCs伴有8/20号染色体非整倍体的改变；该研究还发现，肿瘤患者外周血中可见许多胞膜不完整或完全缺失、但直径>15 μm的裸核，这些裸核都具有8/20号染色体的非整倍体改变。说明该技术不但能鉴定具有完整细胞结构的CTCs，还可鉴定胞质、胞膜不完整或裸核样CTCs的恶性表型。相比于RT-PCR技术，免疫磁珠负性筛选策略的优点是可保证被分离靶细胞的形态和功能完整。其缺点是磁珠的包被效率受抗原包被质量浓度的影响，而该浓度的确定目前尚缺乏统一标准。

2.1.3 Celltracks®AutoPrep®系统 Celltracks®AutoPrep®系统是美国强生公司旗下的Veridex公司开发的，用于肿瘤外周血循环上皮细胞的检测仪，目前已通过FDA认证，可用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的检测[21～23]。其通过抗原抗体反应捕获表达EpCAM的细胞，从而实现对CTCs的富集，将富集的细胞固定后，通过荧光标记细胞角蛋白CK8、CK18和CK19抗体，抗原提呈细胞(APC)标记CD45抗体，用4，6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后，使用自动荧光显微镜进行计数。该系统将CK+、CD45-和DAPI+的细胞定义为CTCs[24]。

目前关于Celltracks®AutoPrep®系统检测食管鳞癌CTCs的研究较少，检出率偏低，其原因可能是部分CTCs因发生了上皮间质转化(EMT)而被漏检。因此，该系统是否适用于食管鳞癌CTCs的检测尚存在争议。Matsushita等[25]研究发现，CTCs在Celltracks®AutoPrep®系统的检出率为27.8%，对部分患者进行随访发现，治疗后部分反应、疾病稳定和疾病进展患者分别占45.1%、16.9%和38%，治疗后CTCs阳性者在疾病进展中的占比例明显高于在部分反应中的比例。CTCs表达水平与患者远处转移明显相关，治疗过程中CTCs表达由阳性变为阴性者，其预后和治疗前CTCs阴性者的预后均较好。表明该系统检测的CTCs结果能有效评估肿瘤患者的预后和放化疗疗效。Hiraiwa等[26]研究发现，Celltracks®AutoPrep®系统对转移性食管癌CTCs的检出率为13%，患者外周血中CTCs阳性率与胸、腹膜转移明显相关，将CTCs的cut off值提高到3、4、5或10，二者仍具有明显相关性。表明晚期食管鳞癌患者CTCs的检测能预测肿瘤的胸、腹膜转移。但Li等[27]研究发现，该系统在食管鳞癌CTCs的检出率仅为1.6%，故建议临床上不使用Celltracks®AutoPrep®系统检测食管鳞癌患者CTCs，其检出率较低的原因有待进一步研究。

Celltracks®AutoPrep®系统集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，被认为是CTCs检测技术的金标准；但该系统无法检出低表达或不表达上皮细胞黏附分子、非上皮表型及发生EMT的CTCs。

2.1.4 ISET技术 ISET技术是一种新型肿瘤细胞富集技术，由Vona等[28]在2000年开创并最先使用于肿瘤研究领域。ISET技术不依赖肿瘤相关标志物检测CTCs，其检测原理是根据肿瘤细胞直径一般大于血细胞的特点，应用纳米技术制作的聚碳酸酯滤过膜，对患者外周血进行滤过，肿瘤细胞因直径大于滤孔而被吸附在滤膜上；然后对肿瘤细胞进行染色，并置于光镜下观察，最后根据CTCs的判定标准鉴别出CTCs。Li等[27]研究发现，ISET技术对食管鳞癌CTCs的检出率为32.8%，该研究首次在患者外周血中检测到循环肿瘤微栓(CTM)，通过免疫荧光技术在CTM中检测到EMT标志物Vimentin的表达，并发现其CTCs检测结果与肿瘤病理分期和患者治疗前血小板计数密切相关。因此认为，ISET技术检测的CTCs结果可作为食管鳞癌临床分期的有益补充，并提示食管鳞癌血行转移与血小板增多关系密切。Bobek等[29]研究发现，ISET技术对食管鳞癌CTCs的检出率为62.8%，该研究成功分离和培养了食管鳞癌患者的CTCs，为进一步分析CTCs的形态学特征提供条件。ISET技术的优点是操作简便，价格低廉，分离后CTCs仍保留活力；缺点是缺乏特异性，一部分直径更小的肿瘤细胞存在被漏检的可能。

2.2 临床评价 目前认为，食管鳞癌CTCs可能具有以下两个特点：①部分CTCs发生了EMT；②CTCs及裸核发生了8/20号染色体的非整倍体改变。在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤的CTCs研究中也存在部分CTCs因发生了EMT而被Celltracks®AutoPrep®系统漏检的问题，因此该系统并不适于食管鳞癌CTCs的检测。RT-PCR技术破坏了细胞，无法对CTCs的染色体进行分析，也不适用于食管鳞癌CTCs的检测；免疫磁珠负性筛选策略和ISET技术能满足食管鳞癌CTCs的检测，后者比前者操作更简便，检测费用更低，并且分离后CTCs仍可保留活力。综合考虑，ISET技术最适用于食管鳞癌CTCs的检测。

目前普遍认为，食管鳞癌CTCs检测在食管鳞癌的早期诊断、治疗和预后评估等方面具有重要的临床意义，尤其是能对治疗效果和患者预后进行实时监控，可使患者获益最大化。相对于乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤，目前关于食管鳞癌CTCs的研究较少；受制于样本量的限制，该领域尚缺少权威的研究结论。

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国家重点研发计划项目(SQ2016ZY04003762)。

李胜(E-mail： drlisheng@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.033

R735.1

A

1002-266X(2017)08-0099-04

2016-08-15)