柠檬精油对变异链球菌及白假丝酵母菌生长及牙菌斑生物膜形成的抑制作用

王小玉，王玉芝，马丽，张向宇

(天津医科大学口腔医学院，天津 300070)

柠檬精油对变异链球菌及白假丝酵母菌生长及牙菌斑生物膜形成的抑制作用

王小玉，王玉芝，马丽，张向宇

(天津医科大学口腔医学院，天津 300070)

目的 探讨柠檬精油对变异链球菌及白假丝酵母菌生长及牙菌斑生物膜形成的抑制作用。方法 采用MTT药敏试验检测不同浓度柠檬精油作用后变异链球菌和白假丝酵母菌的存活率，并记录最低抑菌浓度。将离体牙片置入无菌唾液中，形成获得性膜后，放入变异链球菌或白假丝酵母菌悬液中培养。取出牙片，经不同浓度柠檬精油处理(变异链球菌作用后的牙片柠檬精油浓度分别为0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL，白假丝酵母菌作用后的牙片柠檬精油浓度分别为1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL)，以不含柠檬精油的带菌培养基为阳性对照，记录洗脱液中的菌落数。结果 随着柠檬精油浓度的升高，变异链球菌、白假丝酵母菌的存活率均逐渐降低。柠檬精油对变异链球菌的最低抑菌浓度为0.563 mg/mL，对白假丝酵母菌的最低抑菌浓度为1.125 mg/mL。经0.563、0.281、0.141 mg/mL柠檬精油作用后变异链球菌洗脱液菌落数均低于阳性对照，经1.125、0.563、0.281 mg/mL柠檬精油作用后白假丝酵母菌洗脱液菌落数均低于阳性对照(P均<0.05)。结论 柠檬精油可抑制变异链球菌及白假丝酵菌的生长；柠檬精油亚抑菌浓度即可抑制变异链球菌及白假丝酵母菌在离体牙表面上形成生物膜。

低龄儿童龋；变异链球菌；白假丝酵母菌；生物膜；最低抑菌浓度

低龄儿童龋(ECC)的特点是龋坏进展快、范围广，可对儿童的口腔健康产生严重不良影响[1]。变异链球菌与白假丝酵母菌是导致ECC的关键细菌[1～3]。牙菌斑生物膜是致龋的关键因素，其在获得性膜形成后，可与细菌表面的受体结合，抵抗药物的渗透作用，还可增强微生物对牙釉质的黏附作用。本课题组前期研究发现，柠檬精油可抑制多种牙周致病菌的生长，如变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌等，在亚抑菌浓度(即低于最低抑菌浓度)下即可降低细菌产酸及多种黏附基因的表达[4,5]。2014年1月～2016年6月，本研究观察了柠檬精油对变异链球菌及白假丝酵母菌生长及牙菌斑生物膜形成的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 菌株：变异链球菌ATCC25923、白假丝酵母菌ATCC10261均由天津医科大学基础医学院微生物教研室提供。柠檬精油：采用水蒸气蒸馏法提取。取新鲜柠檬果皮剪切成5 mm×5 mm大小，置于圆底烧瓶中，加入适量水，加热回流40 min，提取收集柠檬精油。离体牙磨片：取正畸拔除的无龋坏双尖牙，常规洗涤，超声清洗后高压消毒，去除牙根后沿近远中径剖成两半；体视显微镜下观察无缺损、裂痕，制成5 mm×5 mm×3 mm大小的釉质牙片，分级抛光备用。主要试剂：PBS、沙氏液体培养基均购于天津瑞泰科技发展有限公司，胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基购于北京陆桥技术股份有限公司，血琼脂培养基购于天津医科大学医学检验制品厂，二甲基亚砜购于天津市光复精细化工研究所，MTT溶液购于美国Sigma公司。

1.2 柠檬精油抑制变异链球菌及白假丝酵母菌生长的观察

1.2.1 变异链球菌、白假丝酵母菌悬液制备及培养 变异链球菌复苏48 h，于37 ℃条件下厌氧环境(20% CO2、80% N2)中采用TSB固体培养基培养24 h。白假丝酵母菌采用沙氏液体培养基复苏48 h，37 ℃恒温箱培养24 h。涂片检查两种细菌均为纯培养后，分别将菌液置于离心机上，3 000 r/min离心5 min，PBS漂洗3次，制备菌悬液，密度均为1×108个/mL。

1.2.2 柠檬精油对变异链球菌、白假丝酵母菌存活率的影响及其最低抑菌浓度 采用MTT药敏试验。将柠檬精油分别用沙氏液体培养基及TPY培养基从9 mg/mL(体积比为1∶100)进行二倍稀释，使其终浓度为9、4.5、2.25、1.125、0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL。分别取不同浓度柠檬精油稀释液50 μL置入96孔板，加入50 μL变异链球菌或白假丝酵母菌悬液，混匀，37 ℃恒温箱内培养24 h；加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续培养4 h；加入二甲基亚砜20 μL，摇匀，记录酶标仪570 nm波长处的光密度(OD)值。以含菌的培养基作为阳性对照，含等量柠檬精油的培养基为空白对照。每个浓度重复4次，取平均值。存活率=(实验孔OD值-空白对照孔OD值)/(阳性对照孔OD值-空白对照孔OD值)×100%。变异链球菌、白假丝酵母菌存活率<30%时的柠檬精油浓度，即最低抑菌浓度。

1.3 柠檬精油抑制变异链球菌及白假丝酵母菌生物膜形成的观察

1.3.1 离体牙片处理 选择口腔健康、无牙周疾病及龋齿的在校小学生1例，分别取其进食、刷牙2 h后非刺激性全唾液，10 000 r/min离心5 min，取上清液。高温消毒，涂片检查确定无菌后备用。取无菌的24孔聚苯乙烯酶标板，每孔置入离体牙片，加入1 mL无菌唾液，室温条件下75 r/5 min摇床培养1.5 h；吸出唾液，形成获得性膜，PBS漂洗备用。

1.3.2 柠檬精油作用后牙片菌落数及黏附率 将经过唾液处理后的离体牙片放入2 mL含有2.5%葡萄糖的变异链球菌悬液中(菌悬液密度为1×107个/mL) ，75 r/5 min摇床培养16.5 h，移除培养基，PBS漂洗去除非黏附细菌，置入新鲜培养基内；每24 h更换一次培养基，培养至72 h。根据1.2.2中变异链球菌的最低抑菌浓度，将离体牙片分别放入0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL柠檬精油中作用3 min，阳性对照中加入不含柠檬精油的带菌培养基。PBS漂洗离体牙片后继续放入培养基中培养，每4 h作用1次，共作用3次，最后置于新鲜培养基中培养16 h[3，6]。参照上法，将唾液处理后的离体牙片放入白假丝酵母菌悬液中培养后，再分别经1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL柠檬精油处理，余操作同变异链球菌。取出离体牙片，放入PBS中震荡漂洗2 min，取10 μL洗脱液均匀涂布于固体培养基中，然后进行菌落计数。采用分光光度计测量570 nm波长下洗脱液与原培养液的OD值。每个浓度重复5次，取平均值。黏附率=洗脱液OD值/(洗脱液OD值+原培养液OD值)×100%。

2 结果

2.1 细菌存活率及柠檬精油最低抑菌浓度 经9、4.5、2.25、1.125、0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL柠檬精油作用，变异链球菌的存活率分别为0.1%、17.2%、18.6%、20.5%、29.9%、43.0%、90.6%、100%，白假丝酵母菌的存活率分别为15.0%、18.2%、21.7%、25.3%、60.5%、63.4%、89.4%、92.6%。柠檬精油对变异链球菌的最低抑菌浓度为0.563 mg/mL，对白假丝酵母菌的最低抑菌浓度为1.125 mg/mL。

2.2 洗脱液菌落数 经0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL柠檬精油处理，变异链球菌的洗脱液菌落数分别为(29.00±19.80)、(102.75±11.53)、(119.75±30.60)、(199.75±24.98)个，阳性对照孔为(304.00±89.56)个；0.563、0.281、0.141 mg/mL柠檬精油作用后变异链球菌的洗脱液菌落数均低于阳性对照孔(P均<0.05)。经1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL柠檬精油处理，白假丝酵母菌的洗脱液菌落数分别为(68.00±11.49)、(80.00±12.36)、(106.00±29.81)、(136.75±26.47)个，阳性对照孔为(172.75±15.69)个；1.125、0.563、0.281 mg/mL柠檬精油作用后白假丝酵母菌的洗脱液菌落数均低于阳性对照孔(P均<0.05)。

2.3 黏附率 经0.563、0.281、0.141、0.071 mg/mL柠檬精油处理，变异链球菌的黏附率分别为45.2%、47.5%、48.2%、50.6%，阳性对照孔为51.9%；两两比较P均>0.05。经1.125、0.563、0.281、0.141 mg/mL柠檬精油处理，白假丝酵母菌的黏附率分别为45.2%、74.5%、79.8%、80.8%，阳性对照孔为82.2%；1.125 mg/mL柠檬精油作用后白假丝酵母菌的黏附率均低于其他浓度及阳性对照孔(P均<0.05)。

3 讨论

白假丝酵母菌对牙齿及牙周组织有极强的黏附作用，而且其耐酸性及产酸能力强，可显著降低釉质硬度并降解胶原Ⅰ，造成牙本质塌陷，以上因素共同作用导致其致龋能力较强[6～11]。变异链球菌与白假丝酵母菌通过葡糖基转移酶-B(GtfB)相互连接，聚集形成菌斑生物膜，而白假丝酵母菌与GtfB的黏附力是变异链球菌的20倍，具有更高的稳定性[8]。研究显示，两菌混合培养的产酸量明显高于变异链球菌单独培养，pH进一步降低，更有利于龋病的发展[12]。

近年研究发现，香茅和肉桂精油有抑制义齿材料表面白假丝酵母菌生长及黏附作用，黄岑素及倒捻子素等也有类似的抑制效果[13,14]。但香茅及肉桂精油作用时间短，无法长期抑制牙菌斑生物膜的形成；而黄岑的具体药理机制目前尚不清楚，且容易导致消化系统不良反应。柠檬精油是从柠檬果皮中提取的芳香类化合物，是食品级天然原料，取材简单，不良反应少，气味宜人。本课题组前期研究发现，柠檬精油可抑制变异链球菌在光滑玻璃片的黏附，低于最低抑菌浓度时即可抑制变异链球菌致龋基因的表达，还可降低细胞外多糖合成[15]，证实其具有防龋潜能。本研究结果显示，随着柠檬精油浓度的升高，变异链球菌、白假丝酵母菌的存活率均逐渐降低，说明柠檬精油可抑制变异链球菌、白假丝酵母菌的生长；1.125 mg/mL的柠檬精油即可使白假丝酵母菌达到最低抑菌浓度，0.563 mg/mL的柠檬精油即可使变异链球菌达到最低抑菌浓度。

牙菌斑生物膜是致龋的关键因素，其形成需要经过获得性膜形成和初期聚集、细菌迅速生长和繁殖、菌斑成熟三个阶段。获得性膜可与细菌表面的受体结合，抵抗药物的渗透作用，还可增强微生物对牙釉质的黏附作用。本研究为模拟人的口腔卫生习惯，每4 h用柠檬精油处理离体牙1次，每次3 min，模仿刷牙、漱口的时间间隔。结果显示，0.563、0.281、0.141 mg/mL柠檬精油作用后变异链球菌的洗脱液菌落数均低于阳性对照，1.125、0.563、0.281 mg/mL柠檬精油作用后白假丝酵母菌的洗脱液菌落数均低于阳性对照；说明亚抑菌浓度的柠檬精油对变异链球菌和白假丝酵母菌的生物膜仍有抑制作用；也表明在不杀灭细菌与真菌的情况下，柠檬精油可抑制变异链球菌、白假丝酵母菌的生物膜对牙面的黏附，在较低的浓度下即可抑制细菌和真菌的生长，保护菌群之间的微生态平衡。本研究不同浓度柠檬精油处理后变异链球菌的黏附率无明显变化，经1.125 mg/mL柠檬精油作用后白假丝酵母菌的黏附率均低于其他浓度及阳性对照，与本课题组前期在光滑聚苯乙烯平板上的结果不同，可能与生物膜降低柠檬精油对变异链球菌黏附的抑制作用有关。柠檬精油对变异链球菌的抑制作用可能与降低其疏水性、减少自由基产生及降低产酸作用有关[16,17]，但其抑制白假丝酵母菌生长的具体机制仍需进一步研究。

综上所述，柠檬精油可抑制变异链球菌及白假丝酵菌生长；柠檬精油亚抑菌浓度即可抑制变异链球菌及白假丝酵母菌在离体牙表面上形成生物膜。

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张向宇(E-mail： xzhang04@tmu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.014

R781.1

A

1002-266X(2017)08-0047-03

2016-07-26)