高效液相色谱法测定叶酸片中叶酸含量

中山大学附属第一医院（510080）黄洁文 雷会雯

叶酸功能主治贫血，疗效较好[1]。叶酸片中的叶酸含量，决定药物治疗效果[2]。有研究表明，采用高效液相色谱法，可有效测定叶酸片中的叶酸含量，效果好，准确度高[3]。本文采用甲醇-水-冰醋酸系统作为流动相，通过试验的方法，在利用高效液相色谱法的基础上，对叶酸片中的叶酸含量进行了分析，试验报告如下。

1 测定仪器与试剂

1.1 测定仪器 测定采用高效液相色谱仪作为主要仪器。另外配合以下仪器完成试验：①UV检测器。②超声波清洗器。③电子天平。④蒸馏器。

1.2 测定试剂 测定包括如下试剂：①叶酸片。②叶酸对照品。③甲醇。④氨水。⑤冰乙酸。

2 测定方法与结果

2.1 测定准备

2.1.1 溶液的配制 共配制两种溶液，一种为供试品溶液，即叶酸片溶液，另一种为对照品溶液，即由所准备的叶酸对照品配制的溶液。供试品溶液配制：①取叶酸片，共30片。②称量，并研磨。③取研磨后的供试品2.5mg置于容量瓶中。④加入氨水（0.5%/15ml）。⑤超声15min。⑥稀释，摇匀并过滤。⑦过滤直至达到溶液要求标准。对照品溶液配制：①取叶酸对照品25.1mg置于容量瓶中。②采用氨水（5%）溶解。③稀释，摇匀并过滤。④过滤直至达到溶液要求标准。

2.1.2 色谱条件 流动相：甲醇-水-冰乙酸。色谱柱：Diamonsil C18柱。柱温：室内温度。流速：1.0ml/min。进样量：20μl。

2.2 测定方法 以试验为主要测定方法，高效液相色谱法为主要测定依据，展开试验，具体测定叶酸含量。包括色谱行为与系统适应性试验、线性关系试验、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、回收率试验与样品含量测定试验。色谱行为与系统适应性试验方法：①室内试验。②流速：1.0ml/min。进样量：20μl。③记录色谱图。线性关系试验方法：①取叶酸对照品溶液0.5ml～4.5ml，（每次增加量为1ml）。②将所取对照品溶液置于容量瓶中。③以水稀释，并摇匀。④进样量：20μl。⑤观察峰面积。⑥做线性回归。精密度试验方法：①取叶酸对照品溶液0.5ml～4.5ml，（每次增加量为1ml）。②重复进样。③进样量：20μl。④观察峰面积。重复性试验方法：①取叶酸样品。②以2:2为标准，制备溶液。③进样量：20μl。④观察峰面积。稳定性试验方法：①以溶液放置时间为变量，测定溶液的稳定性。②取叶酸样品溶液。③控制室温平衡。④放置0h、1h、4h、6h、8h、24h。⑤进样量：20μl。⑤观察峰面积。回收率试验方法：①取叶酸样品。②将样品分为9份。③以2:2为标准，制备溶液。④进样量：20μl。⑤观察峰面积。⑥计算回收率。叶酸含量测定试验方法：①取叶酸样品30片。②研磨。③以2:2为标准，制备溶液。④进样量：20μl。⑤观察色谱图。⑥取叶酸对照品，重复上述试验步骤。⑦观察峰面积。

2.3 测定结果 ①色谱行为与系统适应性试验测定结果 叶酸保留时间10min，与相邻峰分离度在1.5以上，拖尾因子1.03。②线性关系试验测定结果 叶酸在20.8～180.72μg/ml范围内，线性关系良好。③精密度试验测定结果 RSD=0.43%，测定结果表明测定仪器具有较好的精密度。④重复性试验测定结果 RSD=1.7%，测定结果表明重复性较好。⑤稳定性试验测定结果 RSD=0.59%，测定结果表明溶液稳定性较好。⑥回收率实验测定结果 RSD=1.5%，测定结果表明测定准确度较高。⑦叶酸含量试验测定结果 叶酸片标示百分含量为100.5%。

3 结论

采用高效液相色谱法，测定叶酸片的叶酸含量，需同时制备叶酸样品与对照品两种溶液，针对两种溶液同时展开试验，结果准确度更高[4]。试验过程中，控制色谱条件中的进样量较重要，另外，在某些试验中，需控制好室内温度，避免增加变量，影响测定结果的准确度[5]。本文研究发现，根据试验条件的不同，叶酸的稳定性也呈现出了差异：①稀碱条件：叶酸稳定性强，易溶。②水溶液条件下：叶酸稳定性差。

综上所述，高效液相色谱法测定叶酸片中叶酸含量可靠性强、准确度高，可将其用于叶酸片叶酸含量的测定中，提高测量结果准确度，可以以此作为叶酸片叶酸含量的检测方法，评价叶酸片临床应用效果，进一步提高我国药物研制领域发展水平，并为贫血等的治疗，提供质量更高的药物作为依靠。