肌腱损伤中生物制剂研究的最新进展

冯鹏飞，王继宏，冀云涛，赵佳莉

（1.内蒙古医科大学第二附属医院 手外科，内蒙古 呼和浩特 010030；2.手足显微二科）

随着运动的普及，肌腱损伤临床常见，其可导致严重的后果，甚至残疾。据统计，急性跟腱断裂的发病率为每100 000人中就有18人发病，并呈上升趋势。

与骨组织不同，肌腱愈合不能形成同源组织，恢复至未损伤的状态。相反，纤维瘢痕的形成导致肌腱应力弱于原生肌腱。由此产生的力量不足可增加再损伤和其他并发症的风险，如再次断裂或并发肌腱炎等。肌腱损伤的治疗目的是努力恢复原生肌腱的性能，并减少再次断裂及并发症的风险。目前，正在研究利用生物增强技术的疗法在肌腱愈合中潜在的好处。

1 肌腱生理解剖

肌腱是由被称为“肌腱细胞”的成纤维细胞和丰富的胶原细胞外基质组成的纤维结缔组织，在肌肉和骨骼之间建立起的一种特殊连接，通过将收缩力从肌肉传递到骨骼而使身体运动。肌腱的生理和病理特性主要依赖于机械刺激[1]。肌腱表现出较高的机械强度、良好的伸展性和一个最优水平的弹性来执行其独特作用。肌腱的拉伸强度与其直径和胶原含量有关，能承受50～100 kg/cm2的重量[2]。肌腱缺乏血管组织，基础代谢率低，其氧气和营养主要通过内部的肌－腱结和腱骨连接以及外部的腱旁组织和滑膜鞘供应。

2 肌腱损伤的有关因素

肌腱损伤病因复杂，多数学者认为与肌腱承受过度负荷或过度使用有关，其确切病因尚不清楚。⑴开放创伤：如切割伤、电锯伤、挤压伤等，主要与指、足屈伸肌腱断裂有关。⑵血液供应特点：肌腱多缺乏血管组织，外伤导致的血供破坏以及其在解剖结构上存在血管缺乏区的固有弱点易使损伤的肌腱延迟愈合或者不愈合，跟腱表现最为突出。⑶运动创伤：运动中肌腱所承受的张力往往超过其生理负荷，导致肌腱在微观水平上的改变，反复的超生理张力或强大且突然的暴力可导致肌腱的宏观改变，甚至断裂。髌腱和跟腱的损伤与其密切相关。⑷药物：最近的研究表明，我们可能低估了乙酰氨基酚对髌腱损伤的影响，尤其是老年人的髌腱损伤。另外，其他药物包括氟喹诺酮类抗生素、皮质激素、肝素等都显示与肌腱损伤有关。⑸其他：包括年龄、疾病、肺移植、系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺疾病，遗传因素等。目前认为肌腱损伤是多因素影响的结果，包括肌腱血供、损伤、增龄、一些疾病及某些药物、遗传因素等综合作用的结果。

3 生长因子

干细胞的生长分化离不开微环境，微环境中的各种生物活性因子是调控干细胞行使生理功能的重要因素，其中生长因子对于肌腱构建和愈合而言，可起到减少炎症反应、减少瘢痕组织形成、促进正常肌腱功能恢复的作用。肌腱分化因子包括如下。

3.1 富血小板血浆（PRP）

富血小板血浆是由美国红十字会（American Red Cross）定义的，血浆中血小板浓度增加两倍或更高基线水平以上或大于1.1×106血小板/L的样品[3]。富血小板血浆（PRP）已被证明有许多不同的生长因子。高浓度血小板产生颗粒，释放血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子 -β（TGF-β1，TGF-β2异构体）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板源性内皮细胞生长因子（PDEGF）、上皮细胞生长因子（EGF），和胰岛素样生长因子（IGF）[4,5]。由此产生的生长因子池认为可以增强组织恢复，特别是应用在低内在愈合潜力的区域内[6]。富血小板血浆（PRP）注射可刺激炎症反应，导致新的胶原沉积，正如在健康兔跟腱模型显示[7]。与其他生物疗法一样，富血小板血浆（PRP）目标是恢复受损伤肌腱的原生特性。

一些证据支持PRPs可以刺激血运重建和提高在微观水平的愈合能力[8]。在大鼠模型中，注射富血小板血浆（PRP）减少胶原纤维直径，这可能表明促进愈合[9]。然而，在人类慢性跟腱炎中使用的证据依然不足[10-13]。在人类中，跟腱炎使用富血小板血浆（PRP）与对照组安慰剂（placebo）治疗相比，没有更多的好处[14-16]。一些研究表明改善临床症状，由于对照组的缺乏，无法提供充分的证明[17-20]。

富血小板血浆（PRP）对跟腱断裂治疗的有效性应该与其在慢性跟腱炎治疗的有效性区分开来[21]。在大鼠中，大鼠断裂跟腱愈合的早期通过术后注射富血小板血浆（PRP）加强了，用早期纤维蛋白纤维的沉积来证明[22]。在术后注射富血小板血浆（PRP）的断裂的大鼠跟腱也显示了更强的机械应力和增强的新生血管，可以加速愈合，促进瘢痕组织有更好的组织学质量[23-25]。在1例部分肌腱断裂的运动员接受三次富血小板血浆（PRP）注射，未行手术干预的病例研究中已经显示出在人类中潜在的好处。他能够在受伤后仅仅75 d就能回到一场完整的篮球比赛中，18个月后仍然没有出现并发症[26]。另外的6例跟腱断裂的运动员在术后应用富血小板血浆（PRP）治疗后，他们的运动功能更早的恢复，并且用更短的时间恢复训练。通过Sadoghi等[27]进行的10个相关性研究的回顾支持这些发现，证实在跟腱断裂术后应用，富血小板血浆（PRP）较强的积极影响。所有的富血小板血浆（PRP）治疗增加了，DNA水平及GAG水平，虽然低浓度更有效。

为了优化自体血小板治疗的好处，富血小板血浆（PRP）的其他变化也在进行探索。富含生长因子的血浆（PRGF）是一种白细胞缺乏的富血小板血浆（PRP）类型。在体外，富含生长因子的血浆（PRGF）在肌腱生长和迁移中有积极的影响[28]。一个最近在手术治疗跟腱的富含生长因子的血浆（PRGF）动物研究结果与对照组相比，形成组织学上更好的肌腱修复。富含血小板凝块释放(PRCR)是从含有活化的血小板的富血小板血浆（PRP）挤压产生的脱细胞血清。在大鼠跟腱模型中，血小板凝块释放(PRCR)诱导肌腱样分化，同时抑制脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的分化，认为阻碍肌腱愈合[29]。

3.2 骨形态发生蛋白-12（BMP-12）

也被称为生长分化因子-7（GDF-7），骨形态发生蛋白-12（BMP-12）诱导肌腱和韧带组织的形成，能促进干细胞分化为肌腱细胞[30]。这些特性已引起部分学者对肌腱愈合潜在用途的兴趣。Majewski[30]用一种新颖的骨形态发生蛋白-12（BMP-12）的转运方法，利用转基因肌瓣转移至大鼠断裂的跟腱上。BMP-12的应用与对照组相比增加了最大负荷失效，肌腱僵硬（tendon stiffness），胶原蛋白组织和断裂的愈合组织的尺寸。在横断的大鼠跟腱模型中，联合使用BMP-12和BMP-13引起细胞浸润率的增加，增加了组织容积，并改变已知参与肌腱修复的mRNA水平[31]。

有趣的是，添加BMP-12的大鼠跟腱没有影响生长因子的表达[32]。这也许可以解释为什么敲除BMP-12的基因工程对跟腱的组成及超微结构没有显著的影响。另一个可能的解释是其他BMP/GDF家庭成员的代偿[33]。

3.3 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)

在MSC线C3H10T1/2中，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的过度表达导致分化成骨和软骨。当与细胞内蛋白Smad 8共同表达时，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导新肌腱的形成，并阻碍MSCs分化为软骨和骨组织。在设计的Smad8/BMP-2处理的间充质干细胞（MSCs）缺陷的大鼠跟腱显示加速生物力学性能的早期恢复，如有效硬度所示[34]。此外，BMP-2的纤维胶原蛋白在大鼠骨-跟腱损伤修复的使用中具有加速愈合和改善组织的生物力学和组织学特性[35]。

3.4 骨形态发生蛋白-7(BMP-7)

也被称为成骨蛋白（OP-1）、骨形态发生蛋白-7（BMP-7），在体外对BMP和GDF家庭其他成员具有各种影响。动物研究显示BMP-7具有诱导软骨和骨形成以及促进大鼠肌腱愈合和修复的能力[36]。相反，在由Aspenberg[37]进行的回顾中，BMP-7据说减少肌腱的强度和主要支持在损伤肌腱部位的骨生长。不一致的结果可能是由于骨形态发生蛋白7（BMP-7）与BMP和GDF家庭成员参与跟腱修复的复杂的表达模式的调节。

3.5 骨形态发生蛋白-14(BMP-14)

也被称为生长分化因子-5（GDF-5），骨形态发生蛋白-14（BMP-14）是转化生长因子超家族的一个成员。它在肌腱胶原组织的细胞和基因水平上发挥了作用。然而，它与大量的受体相互作用的能力，使其确切作用于细胞的作用机制一直不清楚[38]。它已被证明，在动物研究中，通过各种转移方式促进跟腱愈合。骨形态发生蛋白-14（BMP-14）当注射到异位时会诱导肌腱形成。当其直接注射到肌腱缺损处时，其会提高肌腱的抗张强度[39]。当应用到跟腱成纤维细胞，生长分化因子-5（GDF-5）诱导细胞外基质（ECM）的合成和细胞增殖。其也将增加细胞外基质（ECM）和细胞粘附相关基因的表达[38]。

在动物研究中，生长分化因子-5（GDF-5）多样的转移方法已显示出可喜的成果。生长分化因子-5（GDF-5）的腺病毒基因转移成功是在一个大鼠模型中，生长分化因子-5（GDF-5）的过度表达及增加其抗拉强度无不良免疫反应[40]，并促进损伤肌腱的早期愈合[41]。

3.6 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)有增加胶原蛋白Ⅰ型和Ⅲ型生产的能力。内在的肌腱愈合导致瘢痕的形成为Ⅰ型和Ⅲ型胶原比例的改变。提高天然组织胶原比值的策略是肌腱功能性修复的一个目标。然而，在动物模型中，慢病毒转导的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合MSCs对肌腱重塑的影响可以忽略不计。一个可能的解释是MSCs单独产生充足的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的能力为肌腱重塑所需，使额外的碱性成纤维细胞生长因子转导不必要[42]。

3.7 肝细胞生长因子（HGF）

肝细胞生长因子（HGF）在PRP中发现，并且已知具有抗炎作用。在体外和体内动物研究表明PRP的抗炎作用是由于HGF浓度高[43]。据推测，肝细胞生长因子（HGF）可通过抑制细胞外基质（ECM）的过度表达和减少转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的成肌纤维细胞分化，减少肌腱愈合瘢痕形成。这些肝细胞生长因子（HGF）的影响已经在大鼠跟腱模型中发现[44]。

3.8 重组人血小板源性生长因子-BB(rhPDGF-BB)

重组人血小板源性生长因子-BB(rhPDGF-BB)通过多种机制促进跟腱愈合。在跟腱断裂动物模型中，重组人血小板源性生长因子-BB(rhPDGF-BB)通过基质重塑，胶原合成，血管分布和细胞增殖增加，提高了机械强度和运动范围[45,46]。它的影响被认为是最好的，随着管理时间的推移，其创造了提供方法的发展的兴趣，其将允许在正确的时间段内到修复区域的最佳剂量。提供有前景的方法包括重组人血小板源性生长因子-BB(rhPDGF-BB)涂上一层的缝合和二氧化硅纳米颗粒介孔(MSN)[45,47]。

3.9 转化生长因子β(TGF-β)

转化生长因子（TGF-β）调节细胞的分化和增殖，引起来自肌腱细胞的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原生产增加。胶原纤维主要负责愈合肌腱的机械强度，用TGF-β治疗制定重要的研究区域[48]。用TGF-β1基因转导骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植治疗，注射TGF-β以及通过腺病毒修饰的肌肉移植的TGF-β的输送已经在大鼠跟腱模型中显示可喜的的结果[49-51]。早在术后2周，用TGF-β治疗的修复组织有与自然肌腱相似的组织学表现[52]。TGF-β疗法可通过调节胶原蛋白的合成，交叉链接形成的上调以及增强基质重塑，增加愈合跟腱的机械强度[51]。

3.10 白细胞介素-6(IL-6)

白细胞介素-6（ⅠL-6）刺激蛋白胶原合成的能力已经考虑ⅠL-6作为一种生长因子。在跟腱的腱周区ⅠL-6的间隙浓度在锻炼或机械负荷上明显增加。这引起了在ⅠL-6转化机械负荷为蛋白胶原合成的能力的兴趣。体内研究发现，ⅠL-6浸入跟腱周围的腱周组织导致胶原蛋白合成的增加，无论有或无运动[53]。未来的研究应考虑白细胞介素-6（ⅠL-6）在跟腱修复中的应用，以及用于修复时生物材料的机械刺激的影响。

4 生物因子

4.1 前列腺素 E 2（PGE 2）

来自细胞膜（membranes）的磷脂酶 A 2（PLA 2）释放（liberates）花生四烯酸（AA）。COX-1在大多数哺乳动物细胞中是一种构成酶，然而COX-2是由暴露于生长因子和炎性细胞因子激发的一种诱导酶。COX-2信号通路将花生四烯酸（AA）转化为前列腺素（prostanoids），可细分为三个主要种类，前列腺素（PGs）、血栓素 A 2（TxA 2）和前列腺素Ⅰ2（PGI 2）。前列腺素E合成酶（PGES）稳定的合成（synthesizes）前列腺素PGE 2，且它可以通过前列腺素E受体1–4调节炎症因子。最近研究发现PGE 2剂量依赖性地降低细胞增殖和诱导人肌腱干/祖细胞（TSPCs）的成骨样分化。进行重复的机械负荷增加肌腱中PGE2生产的增加，且PGE 2诱导肌腱干/祖细胞（TSPCs）的非肌腱样分化。近日，同一组发现高浓度的前列腺素E 2（PGE 2）(＞1 ng/mL)降低细胞增殖和人肌腱干/祖细胞（TSPCs）的非肌腱样形成。然而，低浓度的PGE 2(＜1ng/mL)增加细胞增殖和SSEA-4，Stro-1，Nanog，Oct-4，Ⅰ型胶原蛋白和肌腱蛋白 C（tenascin C）的表达。考虑到脂肪形成，胰岛素样生长因子-1（ⅠGF-1）单独是不能诱导肌腱干/祖细胞（TSPCs）成脂分化的，而胰岛素样生长因子-1（ⅠGF-1）和BMP-2一起可以显著诱导肌腱干/祖细胞（TSPCs）成脂分化。在肌腱干/祖细胞（TSPCs）中，PGE2刺激通过cAMP/PKA通路/CEBP通路诱导胰岛素样生长因子-1（ⅠGF-1）表达上调。和BMP-2一起，胰岛素样生长因子-1（ⅠGF-1）在体外可以介导PGE 2诱导的成脂分化。

4.2 地塞米松

糖皮质激素（Glucocorticoids）如地塞米松，已普遍用于缓解肌腱炎的炎症和疼痛。然而，糖皮质激素诱导的肌腱断裂在临床实践中是很常见的。Zhang等表明在低浓度时，地塞米松刺激细胞增殖，同时在高浓度时，增殖能力下降。此外，地塞米松治疗体外诱导人肌腱干/祖细胞的非肌腱样分化，同时移植地塞米松治疗的人肌腱干/祖细胞（hTSPCs）3周时，导致体内脂肪组织、软骨样组织和骨组织的广泛形成。有关研究显示地塞米松通过抑制scleraxis基因，抑制肌腱干/祖细胞的分化。这些发现表明，地塞米松耗尽干细胞池，并导致非肌腱样组织的形成，使肌腱易断裂。

4.3 低氧张力(LOT)

肌腱中，大约总有核细胞的1%～4%是肌腱干/祖细胞（TSPCs）。考虑到肌腱再生和修复，健康肌腱干/祖细胞（TSPCs）的充足数量对于移植是必不可少的。肌腱组织的解剖部位相对氧缺乏，这意味着对于肌腱干细胞培养，低氧可能是必要的。骨髓间充质干细胞（BMSCs）已经证明在2%的氧张力时，保持较高的增殖多分化潜能，克隆形成增加以及更高的细胞代谢。Zhang等发现在低氧张力下培养的肌腱细胞显著增加他们的增殖能力，没有影响他们的功能和表型[54]。Lee等首先描述了人肌腱干/祖细胞在2%氧张力下，增加细胞数量到25%，克隆数量和肌腱相关标志物肌腱调控蛋白的表达，但是降低成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化潜能[55]。在体外培养实验中，5%氧气下培养的肌腱干/祖细胞和在20%氧气中培养的相比，显示更好的细胞增殖和干细胞标志物的表达；此外，当干细胞移植到肌腱来源的基质时，在5%氧气下比在20%氧气中有更多的肌腱样组织形成[56]。因此，低氧（hypoxia）有利于维持培养基中肌腱干/祖细胞的干性以及用到肌腱组织工程时，体外有效的肌腱干/祖细胞扩增。

5 因子联合使用

当使用多种的转运方法，单独应用并到跟腱时，几个以前讨论的增长因素除了其他的，如血管内皮生长因子（VEGF）、软骨衍生形态发生蛋白-2(CDMP-2)以及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)已经表现出积极的影响[57]。Konerding[58]在兔子模型中关键的有丝分裂和血管生成的短期应用，推测在跟腱修复长期结果的改善。然而，腱鞘周围的VEGF，bFGF和PDGF的使用对跟腱修复的治疗只有轻微的影响。使用生长因子的剂量和时间可能是对其影响最小的原因。所有三个选择生长因子为了结合到各自的受体，还需要肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）。损伤对HSPG的影响可能是导致外源性生长因子治疗无效的因素。

6 总结及展望

对于肌腱（或跟腱）断裂及慢性肌腱炎的治疗目前仍是临床的挑战。尽管在骨科手术程序和技术等领域均有重大进展，但对跟腱断裂的治疗方法仍然落后。生物加强在多种疾病中的应用显示出可喜的成果，或许会成为优化跟腱愈合和修复的主要组成部分。然而，这些大部分是实验室研究，我们仍然在等待临床试验，以评估在体内的疗效。

生物制剂不同区域的组合或许是有用的，以优化这些技术的好处。然而，一些参与生物增强的途径的复杂性仍然是一个挑战，以了解他们在体内的相互作用。未来的研究应该着眼寻找这些技术的理想组合，以适合于临床应用。致谢：感谢内蒙古医科大学第二附属医院手足显微二科王继宏导师，王永飞老师的指导及师兄姜东对资料搜集工作的帮助。

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