瑞士乳杆菌的益生功能及应用研究进展

徐 煜,刘振民,游春苹

(乳业生物技术国家重点实验室,上海乳业生物工程技术研究中心, 光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海200436)

瑞士乳杆菌的益生功能及应用研究进展

徐 煜,刘振民,游春苹*

(乳业生物技术国家重点实验室,上海乳业生物工程技术研究中心, 光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海200436)

瑞士乳杆菌具有强大的蛋白水解能力和诸多的益生活性,是当前益生菌研究的热点。本文对瑞士乳杆菌发酵牛乳产生的水解肽的益生活性及相关的蛋白水解系统,瑞士乳杆菌产生的胞外多糖益生活性和瑞士乳杆菌自身的益生活性进行了综述,并总结了瑞士乳杆菌在奶酪发酵中研究进展和新型应用的探索研究。诸多的研究表明,瑞士乳杆菌是一种具有广阔应用前景的益生菌。

瑞士乳杆菌,水解肽,益生功能,胞外多糖,应用

乳酸菌(lactic acid bacterium)是乳品工业中广泛应用的一类重要的益生菌,能调节人体肠道功能,提高免疫能力。乳酸菌主要包括双歧杆菌和乳杆菌,瑞士乳杆菌是乳酸菌中营养缺陷最高的菌种之一,具有强大的蛋白水解能力,其蛋白水解产物具有抗高血压,消炎和抗癌等功能[1]。同时瑞士乳杆菌也是一种安全的益生菌,能调节宿主菌群抑制致病菌。另外,瑞士乳杆菌能适应多种环境,包括高温、低pH、低渗透压、低氧,从而比其他双歧杆菌和乳杆菌更适合制成益生菌制剂[2]。瑞士乳杆菌的诸多功能特性,具有广泛的应用前景,引起了众多研究者的关注。

已有的综述对瑞士乳杆菌的益生功能[2],蛋白水解系统[3]和细胞壁蛋白[1]进行了讨论,丰富了人们对瑞士乳杆菌益生功能的种类,益生功能产生机制的了解。然而相对于其他乳酸菌的研究,对瑞士乳杆菌的报道仍然相对较少,瑞士乳杆菌的益生功能,益生物质和机制等方面仍有待深入研究。本文在已有综述的基础上,结合近5年来瑞士乳杆菌新报道,从瑞士乳杆菌的益生活性产生来源的角度,分三方面综述了瑞士乳杆菌的益生活性,包括来自水解肽的益生活性,来自胞外多糖的益生活性,及菌株自身的益生活性。最后,本文讨论了瑞士乳杆菌的应用研究和新型研究的探索。

1 瑞士乳杆菌水解肽的益生功能及蛋白水解系统

基因序列分析表明,瑞士乳杆菌自身缺乏16种氨基酸的合成,是营养高度缺陷菌[2]。由于瑞士乳杆菌的高度营养缺陷,其自身有一套复杂的蛋白水解系统。在牛乳的发酵过程中,这套蛋白水解系统将牛乳中的酪蛋白水解为多肽,并进一步降解为氨基酸供自身生长利用。和牛乳中的嗜冷菌蛋白水解能力不同,嗜冷菌将牛乳酪蛋白水解形成多肽时,往往形成苦味肽导致牛乳变苦和异味[4]。而瑞士乳杆菌恰恰相反,瑞士乳杆菌往往用于干酪发酵中以降低奶酪的苦味并增加独特风味[5]。不仅如此,瑞士乳杆菌水解牛奶蛋白形成的多肽往往具有独特的益生功能,包括抗高血压和免疫调节能力,从而引起人们的关注[2]。

1.1 水解肽的抗高血压功能

高血压是全球性的重大健康问题,三分之一的西方人和百分之四十的45岁以上的中国人的健康受高血压的影响[6]。高血压病是一种危及生命的慢性疾病,血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)能促使血压升高,是控制高血压的有效靶点[6]。

在1996年,Takano的研究发现,瑞士乳杆菌发酵乳有抗高血压活性。进一步的研究表明,瑞士乳杆菌水解牛乳产生的多肽异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Ile-Pro-Pro,IPP)和异缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Val-Pro-Pro,VPP)具有抑制血管紧张素转化酶(ACE-Inhibitory,ACE-I)活性[7]。目前为止,这两种多肽是研究的最广泛的抗高血压多肽,并被证明在人体和大鼠体内都有功效[6]。

研究发现,不同瑞士乳杆菌菌株发酵乳的ACE-I活性是不同的。在众多不同的瑞士乳杆菌菌株中,大部分的菌株发酵乳都有不同程度的ACE-I活性,例如Yongfu Chen等人从中国和蒙古传统发酵食品中分离出259株瑞士乳杆菌,对其发酵特性的研究结果表明:37株有超过50%的ACE-I的抑制活性,其中菌株H9发酵的酸奶表现出最高的ACE-I抑制活性(86.4%±1.5%),相对短的发酵时间(7.5 h)以及可以检测的多肽浓度:VPP(2.409±0.229) μmol/L和IPP(1.612±0.114) μmol/L[6]。

瑞士乳杆菌发酵乳的抗高血压活性不仅和菌株有关,而且和发酵培养基、发酵时间等条件也密切相关。研究表明,瑞士乳杆菌只有在牛奶发酵中,才会产生抗血管紧张素三肽VPP和IPP,而在豆奶和马奶发酵乳中不产生[8]。在牛乳发酵中,和乳清蛋白浓缩物发酵相比,用脱脂乳培养能支持菌株更好生长并产生更高的蛋白水解活性和体外ACE-I抑制活性[9]。而如果在牛乳中添加蛋白胨或者添加氨基酸,如甘氨酸(Gly),异亮氨酸(Ile),亮氨酸(Leu),苯丙氨酸(Phe),甲硫氨酸(Met),丝氨酸(Ser)和 缬氨酸(Val),则会对发酵奶中的VPP和IPP的产量有明显的抑制[10-12]。通过DNA芯片分析,发现最有可能参与VPP和IPP产生的基因都有下调,这些结果表明,在牛奶发酵中从牛奶多肽中释放的氨基酸可能下调一些蛋白水解系统的基因表达,进而导致瑞士乳杆菌发酵奶中VPP和IPP释放的抑制[10]。

1.2 水解肽的免疫调节功能

瑞士乳杆菌发酵乳具有消炎和抗细菌感染等免疫调节功能,一般而言,这些免疫调节功能被认为是来自菌株自身[2]。但是也有研究发现,瑞士乳杆菌发酵奶的无细胞组分也能对宿主进行免疫调节。瑞士乳杆菌发酵乳能上调IL-6,进而使细胞受保护,抵抗沙门氏菌(Salmonellainfection)的侵害,进一步的研究表明,来自α-乳白蛋白和β-乳清蛋白的肽馏分起主要保护作用,这些肽馏分没有毒性,其保护作用是计量依赖的,其机理可能是刺激机体免疫调控,产生促炎因子TNF-α[13]。瑞士乳杆菌发酵乳中水解肽的免疫调节研究还相对较少。

1.3 蛋白水解系统

瑞士乳杆菌有一套复杂的蛋白水解系统,包括3类:细胞壁蛋白(CEP),细胞膜上转运系统,胞内蛋白[1]。在瑞士乳杆菌发酵过程中,细胞壁蛋白负责将牛乳中蛋白降解为寡肽,寡肽通过细胞膜上的转运系统运送进细胞内,细胞内的胞内蛋白负责将寡肽进一步水解为游离氨基酸。乳酸菌发酵乳中的寡肽一般认为是由CEP催化生成,不同乳酸菌一般有其独特的CEP蛋白,通常CEP蛋白有四类：PrtP,PrtR,PrtS和PrtH,瑞士乳杆菌的CEP属于PrtH蛋白。

瑞士乳杆菌发酵乳中的活性肽是由PrtH蛋白水解αS1-和β-酪蛋白产生[14]。瑞士乳杆菌PrtH主要是水解β-酪蛋白的N端,并优先降解β-酪蛋白的疏水性残基和谷氨酰胺类残基[15]。也有报道发现,瑞士乳杆菌SBT11087 CEP主要降解β-酪蛋白碳端[16]。虽然瑞士乳杆CEP蛋白的研究相对透彻,但是CEP蛋白的基因以及不同CEP蛋白在不同乳酸菌种的分布是需要进一步研究的。

瑞士乳杆菌中,寡肽运输系统涉及的酶:PepE和PepO2,很可能和血管紧张素抑制多肽的产生有关[12],最近报道了一个对支链氨基酸响应的调控因子BCARR,对瑞士乳杆菌蛋白水解系统起负调控作用[17]。然而,在瑞士乳杆菌中,和活性肽产生相关的细胞膜寡肽运输系统,胞内蛋白和蛋白水解系统的调控因子的研究相对较少。

2 瑞士乳杆菌胞外多糖(EPS)的益生功能

益生菌产生的胞外多糖是一类重要的益生元,EPS中含有支链的,重复的糖或糖衍生物的单位,如半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖等。细菌的胞外多糖作为组织成型剂、增粘剂、稳定剂，乳化剂和抗缩水剂，广泛应用于食品行业中[18]。此外,微生物的胞外聚合物已可在医药和制药工业替代免疫调节,抗炎,抗生物膜和抗氧化的药物。瑞士乳杆菌的胞外多糖也不例外。

Dong等人对瑞士乳杆菌MB2-1分泌的胞外多糖进行了系统的研究,研究表明,瑞士乳杆菌MB2-1分泌的胞外多糖对三种食源性致病菌抗生物膜形成能力[18]。他们对瑞士乳杆菌MB2-1胞外多糖粗提物和纯化的多糖研究表明,其胞外多糖对自由基表现出强的清除活性,以及对亚铁离子的螯合活性。他们的抗氧化活性递减的顺序是粗提物>EPS-3>EPS-2>EPS-1[19]。MB2-1胞外多糖LHEPS-1 具有抑制人体结肠癌细胞Caco-2 的增殖的功能[20],胞外多糖LHEPS-2对人体胃癌细胞BGC-823表现出很高的体外抑制活性。并解析了活性最高的LHEPS-2的结构[21]。

另一种瑞士乳杆菌Rosyjski的胞外多糖也具有免疫调节活性[22]。其结构是一个杂多糖,含有D-葡萄糖,D-半乳糖和N-乙酰-D-甘露糖苷的五糖重复单元分支。这个多糖和HT29-19A肠上皮细胞接触后能刺激上皮细胞显著提升促炎因子IL-8的水平。此外,它还能调节Toll类受体的mRNA表达,使得细胞在随后接触细菌抗原时更加敏感。这个结果表明胞外多糖能在通过与肠上皮细胞的特异性作用对肠道稳定发挥潜在的作用。其他瑞士乳杆菌产生的多糖报道相当有限,瑞士乳杆菌的胞外多糖值得进一步研究。

3 瑞士乳杆菌菌体自身的益生功能

3.1 免疫调节功能

瑞士乳杆菌在牛乳发酵过程中产生水解肽以及EPS，具有免疫调节活性,研究表明,菌株自身也表现出了免疫调节作用,包括提高T细胞表达,降低小鼠促炎因子的产生等。

瑞士乳杆菌LH2171能够阻抑免疫细胞的增殖和促炎细胞因子(IL-6和IL-1β)的产生,而阻抑的行为并不是来自于对免疫细胞的毒性[23]。瑞士乳杆菌NS8对人体肠道上皮细胞有良好的结合能力,对小鼠结肠炎有相当的预防作用,促使其抗炎细胞因子IL-10分泌水平的提升[24]。使用适当的益生菌保护咽粘膜，是预防上呼吸道和尿道感染的策略。MIMLh5和 ST3菌株的新型产品能对咽粘膜有益生作用，并能预防上呼吸道和尿道感染,瑞士乳杆菌MIMLh5能有效粘附于咽上皮细胞,对抗化脓链球菌,以及通过显著诱导炎性肿瘤细胞坏死因子α(TNF-α)的表达,从而激活U937巨噬细胞,进而调节宿主的先天免疫[25]。瑞士乳杆菌HY7801可以通过抑制NF-κB细胞通路和阻抑白色念珠菌的生长改善外阴阴道念珠菌病。用瑞士乳杆菌HY7801(LH)进行口服或阴道治疗的小鼠,其阴道内活性白色念珠菌水平和阴道组织内量化的髓过氧化物酶活性明显降低，有效抑制外阴阴道念珠菌病[26]。同时研究表明瑞士乳杆菌能减轻婴儿牛奶过敏患者对牛奶的过敏反应,乳杆菌蛋白酶对αS1-和β-酪蛋白的水解降低了人体免疫球蛋白IgE的特异性识别[14]。

虽然益生菌对宿主的健康有益,但是他们的有效性是菌株特异的。发展有效的筛选模型,是研究的热点。为筛选抗炎益生菌,近期Kim等人发展了一套体外筛查系统,并通过实验性关节炎作为体内模型,以IL-10上调和IL-12下调作为筛选标准,建立了益生菌筛选方法[27]。结果证实,口服筛选得到的瑞士乳杆菌HY7801能预防胶原诱导的实验性关节炎,并通过降低特异性抗原IgG的水平以及免疫反应,减轻疾病的发展和严重程度。

乳酸菌菌株的益生功能和其细胞外被膜上的S-层蛋白(Surface Layer Protein)密切相关。S-层蛋白是细胞外被膜蛋白的粘附位点,赋予细胞疏水特性,以及和肠上皮及其他细胞特异的作用能力,其关系到细菌的益生通路形成[28]。S-层蛋白已经在几株瑞士乳杆菌中证实,他们组成了细胞外包被的最外层结构,他们是一组仅仅由非共价键结合的蛋白。S-层蛋白的功能除了和肠道粘附,还有保护细胞对抗肠道消化酸和酶的作用,决定细胞形状,分子和离子捕获附。研究表明,瑞士乳杆菌的S-层蛋白的氨基酸组成,二级结构和生理特性和来自其他乳酸菌的S-层蛋白非常相似[29]。和S-层蛋白合成相关的基因slpH,虽有一定保守性,但不能作为看家基因。通过检测S-层蛋白进而筛选具有免疫活性的瑞士乳杆菌,是一种有效的筛选方法。Milda发展了免疫活性的单链可变片段scFvs克隆抗体,这个抗体能特异结合瑞士乳杆菌的S-层蛋白,具有检测乳制品中瑞士乳杆菌S-层蛋白的能力[30]。

3.2 对宿主行为的调节

肠道菌群能通过肠脑轴对宿主的行为产生影响,研究表明,瑞士乳杆菌也具有精神类调节功能。瑞士乳杆菌R0052和双歧杆菌R0175的益生菌制剂能缓解大鼠的焦虑和人类志愿者的心理压力[31]。进一步的研究表明,宿主的饮食类型,是否有炎症可能明显改变瑞士乳杆菌对大鼠焦虑行为的调节[32]。瑞士乳杆菌对宿主行为的调节仍有待进一步研究。

4 瑞士乳杆菌的应用

4.1 瑞士乳杆菌的传统应用

瑞士乳杆菌是瑞士干酪和意大利干酪生产中的传统用菌[33],瑞士乳杆菌在奶酪发酵中,通常被认为具有降低奶酪苦味并加速风味形成的能力,也能在牛奶中释放生物活性肽[34],同时代谢掉残余的碳水化合物以抑制产气微生物的生长[35]。在奶酪成熟过程中,瑞士乳杆菌降解酪蛋白形成的低水解度酪蛋白以及一类特殊疏水性多肽,这些多肽和奶酪的拉丝性能密切相关[36]。

奶酪的风味形成和奶酪成熟过程中瑞士乳杆菌自降解释放胞内肽酶密切相关。瑞士乳杆菌的自降解与瑞士乳杆菌细胞壁多糖结构和肽聚糖水解酶(Peptidoglycan hydrolases,PGHs)相关[37]。肽聚糖水解酶(Peptidoglycan hydrolases，PGHs)是一种细胞酶能水解细胞壁的肽聚糖导致自溶。有九个编码PGHS的基因已经在高降解瑞士乳杆菌菌株DPC4571中被注释[37]。这些基因在瑞士乳杆菌中分布性的不同,对奶酪风味有重要影响。检测瑞士乳杆菌蛋白酶或肽酶基因,以及肽聚糖水解酶是开发新型风味奶酪发酵菌的重要方法。

4.2 瑞士乳杆菌应用新探索

4.2.1 发酵中的新应用 随着瑞士乳杆菌关注度的提高,牛乳发酵之外的新型应用也有诸多报道。除了用于牛乳发酵,瑞士乳杆菌还被尝试用于黑面包的发酵过程[38],和酵母混合用于谷物发酵以制作饮料[39],以及绿豆乳发酵[40]。

研究发现,瑞士乳杆菌具有抗真菌活性,来源自有机酸和菌株KLDS 1.8701自身[41]。此菌在豆奶发酵和储藏过程中,能抑制Penicilliumsp.及其他来自环境的腐败微生物并能延长产品的货架期。在发酵豆奶中添加KLDS 1.8701对产品的生化性质,流变性质和口感都没有明显影响。他能增强乳酸菌(瑞士乳杆菌和保加利亚乳杆菌)的活菌数,并不影响嗜热链球菌。因此,在其他发酵产品中,瑞士乳杆菌 KLDS 1.8701也可以被用做生物保护基。

4.2.2 其他新应用 由于其安全性,瑞士乳杆菌的应用研究不只局限于食品中。在瑞士乳杆菌的其他代谢产物的应用方面,Sharma等人报道了瑞士乳杆菌产生一种主要由脂肪酸和糖片段组成生物表面活性剂,能将pH7.2的磷酸盐缓冲液的表面张力从72.0降低至39.5 mN·m-1。这种乳酸菌生物产生无毒表面活性剂在新兴的生物医学领域有相当的应用前景[42]。在瑞士乳杆菌菌体应用方面,陈刚等人发现,在大菱鲆幼鱼养殖中使用瑞士乳杆菌和其他有益微生物的组合,能有效地提高大菱鲆幼鱼的成活率，改善养殖环境[43]。

由于其强大的蛋白水解能力,瑞士乳杆菌还被应用于工业的生产中,以降低生产成本和环境污染。例如,Arbia等人尝试用筛选瑞士乳杆菌降解蛋白提取角素,以取代工业生产中强酸、强碱和高温的极端条件。经过条件优化,可以达到98%的脱矿率和78%的蛋白降解率,具有良好的应用前景[44]。

5 结论

瑞士乳杆菌水解酪蛋白产生抗高血压多肽,是其独特的发酵特点,发酵过程中调控抗高血压多肽的产生是研究的热点。除了筛选特定瑞士乳杆菌的菌株和优化发酵条件之外,对瑞士乳杆菌蛋白水解系统中涉及抗高血压肽产生的蛋白酶和调控因子的研究,是进一步提高抗高血压多肽的产量的基础研究方向。瑞士乳杆菌自身及发酵产物除了抗高血压之外,还有调节免疫(抑菌,消炎和抗癌)和调节宿主行为的活性。这些益生活性都有待继续深入研究。

奶酪是西方重要的奶制品,瑞士乳杆菌在奶酪成熟过程中扮演重要作用。瑞士乳杆菌能降低奶酪苦味,增强拉丝性能和产生独特风味,研究与这些功能相关的蛋白酶,肽酶和寻找与之相关的基因是重要的研究课题。

虽然瑞士乳杆菌益生功能已被广泛报道,但是其产生的活性物质以及新型应用还有待人们进一步认识和开发。综上所述,瑞士乳杆菌是一种具有广阔发展前景的益生菌。

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Research progress on the probiotic function and application ofLactobacillushelveticus

XU Yu,LIU Zhen-min,YOU Chun-ping*

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology, Research Center of Bright Dairy & Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China)

With a strong ability of protein hydrolysis and many probiotic functions,Lactobacillushelveticushas become a hot spot in research of probiotic bacteria. In this paper,probiotic activities of hydrolyzed peptides originated inL.helveticusfermented milk and the related proteolytic system ofL.helveticus,probiotic activities of extracellular polysaccharides produced byL.helveticusand probiotic activities ofL.helveticusstrains were reviewed. At last,the research progress and new applications ofL.helveticusin cheese fermentation were also summarized. Many studies have indicated thatLactobacillusis a kind of probiotics with broad application prospects.

Lactobacillushelveticus;hydrolyzed peptide;probiotic function;extracellular polysaccharide;application

2016-09-22

徐煜(1986-),男,博士,研究方向:乳品安全,E-mail:xuyuhuaxuexi03@126.com。

*通讯作者:游春苹(1981-),女,博士,高级工程师,研究方向:乳品安全,E-mail:youchunping@brightdairy.com。

国家“十二五”科技支撑计划(2013BAD18B01);上海市科委项目(16DZ2280600);上海市闵行区领军人才项目(201443)。

TS252.1

A

1002-0306(2017)08-0374-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.064